誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在酒精性肝病大鼠模型肝臟中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是長期大量飲酒所致的肝臟損害性病變，其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關(guān)于ALD的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，近年來有人提出以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”假說，“第一次打擊”使脂類沉積在肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂肪肝，“第二次打擊”涉及內(nèi)毒素、細(xì)胞因子參與的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。一氧化氮合酶（nitric oxide synth

2、ase，NOS）是合成一氧化氮（nitric oxide，NO）的一種關(guān)鍵酶，目前發(fā)現(xiàn)至少有3種亞型，分別為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）和神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）。其中與肝臟疾病有關(guān)的主要為iNOS和eNOS。在生理狀態(tài)下，肝組織中主要表達(dá)eNOS，而iNOS無表達(dá)或僅有較少表達(dá)。當(dāng)肝組織受損時(shí)，肝細(xì)胞則大量表

3、達(dá)iNOS，催化產(chǎn)生大量的NO。NO在大量活性氧存在的條件下，與超氧陰離子（superoxide anion，O2-）快速反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽（peroxynitrite，ONOO-），后者能夠硝化蛋白質(zhì)酪氨酸，生成硝基酪氨酸（nitrotyrosine，NT），從而影響細(xì)胞的能量和脂質(zhì)代謝以及細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。本研究旨在應(yīng)用酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用免疫組織化學(xué)染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcript

4、ion-polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法觀察NT、iNOS及iNOS mRNA的表達(dá)情況，探討iNOS在ALD發(fā)病過程的表達(dá)及意義，為有效防治ALD提供新的思路。
　　 方法：選用雄性健康清潔級(jí)Wister大鼠50只，體重200±20g，正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分出10只為正常對照組，其余動(dòng)物采用逐漸增加酒精濃度（濃度30％-60％，乙醇5-9g·kg-1·d-1）的方法酒精灌胃，分別于4周、8

5、周、12周和16周末隨機(jī)處死動(dòng)物8只、8只、8只和9只，留取血清及肝組織標(biāo)本并制備10％的肝勻漿，應(yīng)用日本OLYMPUS AU600全自動(dòng)生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和乙酰膽堿酯酶（cholinesterase，CHE）；應(yīng)用比色法檢測肝勻漿肝組織蛋白含量，以g（mg）為單位分別測定肝勻漿

6、甘油三酯（triglyceride，TG）、氧自由基（oxygen free radical，OFR）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量；取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色，觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況；另取肝組織固定于4％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋，5μm切片行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織的普通病理改變，天狼

7、紅染色觀察肝組織纖維化程度；并用石蠟切片進(jìn)行iNOS、NT免疫組織化學(xué)染色，觀察肝組織iNOS、NT、的表達(dá)情況；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用RT-PCR觀察大鼠肝組織iNOS mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清生化指標(biāo)的變化：隨著造模時(shí)間的延長，血清ALT和AST逐漸升高，CHE逐漸降低，與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 2、肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化：隨著造模時(shí)間的

8、延長，肝組織勻漿TG、OFR及MDA含量逐漸升高，SOD含量逐漸降低，與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 3、肝組織病理學(xué)改變：4周大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞脂肪變性，隨著造模時(shí)間的延長，肝細(xì)胞脂肪變性逐漸加重，肝小葉內(nèi)壞死灶明顯增多和纖維組織增生，16周大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫微囊泡樣脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切片蘇丹Ⅳ染色顯示正常對照組大鼠肝組織無脂肪變性，模型4周組大

9、鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴，隨著造模時(shí)間延長，紅色脂滴逐漸增多，至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細(xì)胞內(nèi)。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生，模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形成趨勢，模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4、免疫組化法檢測大鼠肝組織iNOS及NT的表達(dá)：光鏡下，正常對照組大鼠肝組織內(nèi)僅有少量iNOS及NT表達(dá)，隨著造模時(shí)間的延長陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)，主要表達(dá)于肝細(xì)

10、胞胞漿內(nèi)。與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 5、RT-PCR法檢測iNOS mRNA的表達(dá)量：正常對照組大鼠肝組織中僅表達(dá)少量iNOS mRNA，隨著造模時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸增加，與正常對照組比較P<0.05或P<0.01。
　　 6、肝組織中NT的表達(dá)量與iNOS mRNA表達(dá)水平呈正比，相關(guān)系數(shù)為0.71，P<0.01。
　　 7、肝組織中NT表達(dá)量與血清AST水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.6

11、5，P<0.01，與CHE呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.54，P<0.01。
　　 8、肝組織中NT的相對表達(dá)量與肝勻漿中OFR和MDA的含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.84和0.82，P值均<0.01，與SOD呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.69，P<0.01。
　　 9、肝組織中iNOS mRNA的相對表達(dá)量與血清AST水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.42，P<0.01，與CHE呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.52，P<0.01。

12、>　　 10、肝組織中iNOS mRNA的相對表達(dá)量與肝勻漿中氧化指標(biāo)OFR和MDA的含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.57和0.66，P值均<0.01，與抗氧化指標(biāo)SOD呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.46，P<0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型，該模型肝臟病變?nèi)缰{變性、炎癥反應(yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2、iNOS表達(dá)增強(qiáng)所致的