繁茂膜海綿原細胞的鑒別、分離純化和體外培養(yǎng)研究.pdf

1、海綿是一種重要的海洋藥用無脊椎動物.海綿細胞體外培養(yǎng)是解決海綿藥物供給不足問題最具希望和富有挑戰(zhàn)性的課題.本研究旨在發(fā)展一種海綿干細胞體外培養(yǎng)方法,探索利用海綿干細胞體外培養(yǎng)建立海綿細胞系的可能性.論文以大連海域繁茂膜海綿的干細胞-原細胞為對象,研究了原細胞的鑒別、分離純化及體外培養(yǎng)(增殖和分化)等問題. 首先,考察了繁茂膜海綿主要類型細胞在光、電鏡下的形態(tài)結構特征.形成了在光鏡下鑒別、計數(shù)原細胞的方法和標準.并應用BrdU攝取

2、法和PCNA檢測法,進一步證明了原細胞作為海綿干細胞所具有的增殖分裂潛力. 第二,建立了一種分離、純化原細胞的新方法.利用原細胞與其它類型細胞的差異,形成了差速離心、選擇性聚集、差速粘附和密度梯度離心四步集成分離方法.有效地實現(xiàn)了原細胞的富集,富集濃度達到了80﹪以上. 第三,比較了原細胞含量不同細胞體系的體外培養(yǎng)增殖特征.初步發(fā)現(xiàn),原細胞具有活躍的增殖能力；高富集度原細胞體外原代培養(yǎng)過程中所顯示的增殖和生物量增加能力,

3、顯著優(yōu)于混合細胞和低濃度原細胞培養(yǎng),首次實現(xiàn)了總細胞的倍增,顯示了以原細胞為基礎建立傳代細胞系的可能性.高富集原細胞連續(xù)兩次傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),由于原細胞的分化等原因,其增殖速率明顯下降. 論文還研究了上皮和膠原細胞對原細胞分化的影響.初步發(fā)現(xiàn),當該兩種細胞與原細胞比例大于2:1混合培養(yǎng)時,所形成的細胞聚集體將分化成功能性小海綿.而高富集度原細胞培養(yǎng),雖能發(fā)生一定分化,但不能發(fā)育成小海綿. 最后,本研究分離提取了造骨細胞特異性