接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)

1、第四章 接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù),第一節(jié) 培養(yǎng)基制備技術(shù)第二節(jié) 接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié) 常用的微生物培養(yǎng)基——原理、制作和現(xiàn)象（自學）,第一節(jié) 培養(yǎng)基制備技術(shù),一、玻璃器皿的清洗,在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過一定的處理，洗刷干凈。有的還要進行包裝，經(jīng)過滅菌等準備就緒后，才能使用。,二、培養(yǎng)基的類型,

2、在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基（Media）。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。,1、根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分是否完全了解來區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基。,天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉

3、膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號等因素的影響。,1）天然培養(yǎng)基,2）合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學成分精確、重復

4、性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。,3）半合成培養(yǎng)基,在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。,2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基。,3、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為：選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒

5、別培養(yǎng)基等。,三、培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項,1、培養(yǎng)基配方的選定,同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規(guī)定進行配制外，一般均應盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。,2、培養(yǎng)基的制備記錄,每次制備培養(yǎng)基均應有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等，記錄應復制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，復制?/p>

6、錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。,3、培養(yǎng)基成分的稱取,培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方上做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。,4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化,培養(yǎng)基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細菌不易生長。最好使用不

7、銹鋼加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。,5、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正,因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行pH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低 pH 0.2，而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此，對這個步驟，操作者應隨時注意探索經(jīng)驗、以期能掌握培養(yǎng)基的最終pH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。pH調(diào)整后，還應將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。,6、培養(yǎng)基的過濾澄清,液

8、體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。,瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60℃的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝

9、入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個雞蛋的蛋白，強力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121℃加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。,7、培養(yǎng)基的分裝,培養(yǎng)基的分裝，應按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應以能形

10、成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。,分裝容器應預先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。,8、培養(yǎng)基的滅菌,一般培養(yǎng)基可采用121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。,某些畏熱成分，如糖類，應另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)

11、基。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50℃左右的培養(yǎng)基中。瓊脂斜面培養(yǎng)基應在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當斜面，待其自然凝固。,9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試,每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。將全部培養(yǎng)基放入36±1℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。,用有關(guān)的標準

12、菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時，如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應棄去，不能使用。,10、培養(yǎng)基的保存,培養(yǎng)基應存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標簽。,第二節(jié) 接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù),一、接種,將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。,1

13、、接種工具和方法,在實驗室或工廠實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。,接種和分離工具1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀,常用的接種方法有以下幾種：,1）劃線接種,這是最常用的接種方法。即在

14、固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。,2）三點接種,在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進行接種的。,3）穿刺接種,在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做

15、法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。,4）澆混接種,該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。,5）涂布接種,與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均

16、勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。,6）液體接種,從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。,7）注射接種,該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。,8）活體接種,活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于

17、活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。,2、無菌操作,培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。,實驗臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于培

18、養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實驗臺上方，空氣流動應緩慢，雜菌應盡量減少，其周圍雜菌也應越少越好。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實驗室的門窗，并用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。,斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞,二、分離純化,含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。如果在一個菌落中所有細胞均來自

19、于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）。在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。,1、傾注平板法,首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便

20、可得到純培養(yǎng)物。,2、涂布平板法,首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。,1、傾注平板法,2、涂布平板法,操作較麻煩，對好氧菌、熱敏感菌效果不好！,使用較多的常規(guī)方法，但有時涂布不均勻！,3、平板劃線法,最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見

21、的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細胞長成一個菌落。,平板劃線分離法1.斜線法 2.曲線法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,三、培養(yǎng),微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、ＰＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡

22、相同。,2、培養(yǎng)方法,1）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。,好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。,厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列

23、幾種方法：,a. 降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達到目的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。,b. 化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。,c. 隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d. 替

24、代驅(qū)氧：用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮氣驅(qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。,第三節(jié) 常用的微生物培養(yǎng)基——原理、制作和現(xiàn)象,牛肉膏　　　　　　 5g蛋白胨　　　　　　 10g氯化鈉　　　　　　 3g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)　　 2g

25、0.2%滇麝香草酚藍溶液　 12mL蒸餾水　　　　　　 1000mLpH7.4,1、糖發(fā)酵管,1）成分,2）制法,① 葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。 ② 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶100mL，121℃高壓滅菌15 min。另將各種糖類分別配好

26、10%溶液，同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。 　　注：蔗糖不純，加熱后會自行水解者，應采用過濾法除菌。,3）試驗方法,從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36±1℃培養(yǎng)，一般觀察2～3d。遲緩反應需觀察14～30d。,2、ONPG培養(yǎng)基,1）成分,鄰硝基酚β－D-半乳糖昔(ONPG)　　 60mg (O-Nitrophenyl-β-D-galactopyrano

27、side)0.01mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5)　　　　10mL1%蛋白胨水(PH7.5)　　　　　　　　　30mL,2）制法,將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于10mm×75mm試管，每管0.5mL，用橡皮塞塞緊。,自瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物1滿環(huán)接種，于36±1℃培養(yǎng)1～3h和24h觀察結(jié)果。如果β-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1～3h變黃色，如無此酶則24h不變色。,3）試驗方法,3、緩沖

28、葡萄糖蛋白胨水 （MR和VP試驗用）,1）成分,磷酸氫二鉀　　 5g蛋白胨　　　　　7g葡萄糖　　　　　5g蒸餾水　　　　　1000mLpH7.0,2）制法,3）甲基紅(MR)試驗,溶化后校正pH，分裝試管，每管1mL，121℃高壓滅菌15min。,自瓊脂斜面挑取少量培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)2～5d，哈夫尼亞菌則應在22～25℃培養(yǎng)。滴加甲基紅試劑

29、一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色為陰性。甲基紅試劑配法：10mg甲基紅溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸餾水。,4）V-P試驗,用瓊脂培養(yǎng)物接種本培養(yǎng)基中，于36±1℃培養(yǎng)2～4d。哈夫尼亞菌則應在22～25℃培養(yǎng)。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽性反應立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應放在36±1℃下培養(yǎng)4h再進行觀察。,4、西蒙氏檸

30、檬酸鹽培養(yǎng)基,1）成分,氯化鈉　　　　　　　　　　5g　硫酸鎂(MgSO4·7H2O)　　　 0.2g磷酸二氫銨　　　　　　　　1g磷酸氫二鉀　　　　　　　　1g檸檬酸鈉　　　　　　　　　5g瓊脂　　　　　　　　　　　20g蒸餾水　　　　　　　　　　1000mL0.2%溴麝香草酚藍溶液　　 40mLpH6.8,2）制法,3）試驗方法,先將鹽類溶解于水內(nèi)，校正pH，再加瓊脂，加熱溶化。然后加入指示劑，混合均勻

31、后分裝試管，121℃高壓滅菌15min。放成斜面。,挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種，于36±1℃培養(yǎng)4d，每天觀察結(jié)果。陽性者斜面上有菌落生長，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍色。,5、克氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基,1）成分,檸檬酸鈉　　　　　　　　　　　 3g葡萄糖　　　　　　　　　　　　 0.2g酵母浸膏　　　　　　　　　　　 0.5g單鹽酸半胱氨酸　　　　　　　　 0.1g磷酸二氫鉀　　　　　　　　　　 1g氯化鈉　　　　　　　　　　　　 5

32、g0.2%酚紅溶液　　　　　　　　　6mL瓊脂　　　　　　　　　　　　　 15g蒸餾水　　　　　　　　　　　　 1000mL,2）制法,3）試驗方法,加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15min。放成斜面。,用瓊脂培養(yǎng)物接種整個斜面，在36±1℃培養(yǎng)7d，每天觀察結(jié)果。陽性者培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。,6、丙二酸鈉培養(yǎng)基,1）成分,酵母浸膏　　　　　　　　　 1g硫酸銨　　　　　　　　　　 2g磷酸氫二鉀　　　　　　　　 0

33、.6g磷酸二氫鉀　　　　　　　　 0.4g氯化鈉　　　　　　　　　　 2g丙二酸鈉　　　　　　　　　 3g0.2%溴麝香草酚藍溶液　　　12mL蒸餾水　　　　　　　　　　 1000mLpH6.8,2）制法,3）試驗方法,先將酵母浸膏和鹽類溶解于水，校正pH后再加入指示劑，分裝試管，121℃高壓滅菌15min。,用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{色。,7、葡葡糖銨培養(yǎng)基,1）

34、成分,氯化鈉　　　　　　　　　　　5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)　　　 　 0.2g磷酸二氫銨　　　　　　　　　1g磷酸氫二鉀　　　　　　　　　1g葡萄糖　　　　　　　　　　　2g瓊脂　　　　　　　　　　　　20g蒸餾水　　　　　　　　　　　1000mL0.2%溴麝香草酚藍溶液　　　 40mLpH6.8,2）制法,先將鹽類和糖溶解于水內(nèi)，校正pH，再加瓊脂，加熱溶化，然后加入指示劑，混合均勻后分裝試管，

35、121℃高壓滅菌15min，放成斜面。,注：容器使用前應用清潔液浸泡。再用清水、蒸餾水沖洗干凈，并用新棉花做成棉塞，干熱滅菌后使用。如果操作時不注意，有雜質(zhì)污染時，易造成假陽性的結(jié)果。,3）試驗方法,用接種針輕輕觸及培養(yǎng)物的表面，在鹽水管內(nèi)做成極稀的懸液，肉眼觀察不見混濁，以每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20～100之間為宜。將接種環(huán)滅菌后挑取菌液接種，同時再以同法接種普通斜面一支作為對照。于36±1℃培養(yǎng)24h。陽性者葡萄糖銨斜面上有

36、正常大小的菌落生長；陰性者不生長，但在對照培養(yǎng)基上生長良好。如在葡萄糖銨斜面生長極微小的菌落可視為陰性結(jié)果。,8、Hugh-Leifson培養(yǎng)基(O/F試驗用),1）成分,蛋白胨　　　　　　　　　　　　2g氯化鈉　　　　　　　　　　　　5g磷酸氫二鉀　　　　　　　　　 0.3g瓊脂　　　　　　　　　　　　　4g葡萄糖　　　　　　　　　　　　10g0.2%溴麝香草酚藍溶液　　　　 12mL蒸餾水　　　　　　　　　　　

37、　1000mLpH7.2,2）制法,將蛋白胨和鹽類加水溶解后，校正pH至7.2。加入葡萄糖、瓊脂煮沸，溶化瓊脂，然后加入指示劑?；靹蚝?，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，直立凝固備用。,3）試驗方法,從斜面上挑取小量培養(yǎng)物作穿刺接種，同時接種兩支培養(yǎng)基，其中一支于接種后滴加溶化的1%瓊脂液于表面，高度約1cm，于36±1℃培養(yǎng)。,9、馬尿酸鈉培養(yǎng)基,1）成分,馬尿酸鈉　　1g肉浸液　　　100mL,2）制法,將馬尿酸鈉

38、溶解于肉浸液內(nèi)，分裝于小試管內(nèi)，并于管壁畫一橫線。以標志管內(nèi)液面高度，高壓滅菌121℃20min。,3）試劑,三氯化鐵(FeCl3·6H2O)12g，溶于2%鹽酸溶液100mL中即成。,4）試驗方法,用純培養(yǎng)物接種，于42℃培養(yǎng)48h，觀察培養(yǎng)液是否到達試管壁上記號處，如不足時，用蒸餾水補足至原量。經(jīng)離心沉淀，吸取上清液0.8mL，加入三氯化鐵試劑0.2mL，立即混合均勻，經(jīng)10～15min，觀察結(jié)果。,出現(xiàn)恒久之沉淀物為陽性

39、。,5）結(jié)果,10、營養(yǎng)明膠,1）成分,蛋白胨　　　　　5g牛肉膏　　　　　3g明膠　　　　　　120g蒸餾水　　　　　1000mLpH6.8～7.0,2）制法,加熱溶解、校正至pH7.4～7.6，分裝小管，121℃高壓滅菌10min，取出后迅速冷卻，使其凝固。復查最終pH應為6.8～7.0。,3）試驗方法,用瓊脂培養(yǎng)物穿刺接種，放在22～25℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，記錄液化時間?；蚍旁?6±1℃培養(yǎng)，每天取出，放冰箱內(nèi)

40、30min后再觀察結(jié)果。,11、苯丙氨酸培養(yǎng)基,1）成分,酵母浸膏　　　　　　　　　　　 3gDI-苯丙氨酸(或L－苯丙氨酸1g)　 2g磷酸氫二鈉　　　　　　　　　　 1g氯化鈉　　　　　　　　　　　　 5g瓊脂　　　　　　　　　　　　　 12g蒸餾水　　　　　　　　　　　　 1000mL,2）制法,3）試驗方法,加熱溶解后分裝試管，121℃高壓滅菌15min，使成斜面。,自瓊脂斜面上挑取大量培養(yǎng)物，移種于苯丙

41、氨酸瓊脂，在36±1℃培養(yǎng)4h或18～24h。滴加10%三氯化鐵溶液2～3滴，自斜面培養(yǎng)物上流下，苯丙氨酸脫氨酶陽性者呈深綠色。,12、氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基,1）成分,蛋白胨　　　　　　　　　　5g酵母浸膏　　　　　　　　　3g葡萄糖　　　　　　　　　　1g蒸餾水　　　　　　　　　　1000mL1.6%滇甲酚紫-乙醇溶液　　 1mLL-氨基酸或DL-氨基酸　　 0.5或1g/100mLpH6.8,2）制

42、法,除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶100mL，分別加入各種氨基酸：賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。對照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL，上面滴加一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。,3）試驗方法,從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36±1℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因

43、葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應為黃色。,13、蛋白胨水(靛基質(zhì)試驗用),1）成分,蛋白胨(或胰蛋白胨)　 20g氯化鈉　　　　　　　 5g蒸餾水　　　　　　　 1000mLpH7.4,2）制法,按上述成分配制，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min。,3）靛基質(zhì)試劑,柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸25mL。 歐-波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95mL9

44、5%乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20mL。,4）試驗方法,挑取小量培養(yǎng)物接種，在36±1℃培養(yǎng)1～2d，必要時可培養(yǎng)4～5d。加入柯凡克試劑約0.5mL，輕搖試管，陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑約0.5mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面，陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。　　注：蛋白胨中應含有豐富的色氨酸。每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。,14、硫酸亞鐵瓊脂(硫化氫試驗用),1）成分,牛肉膏　　　　　　

45、3g酵母浸膏　　　　　 3g蛋白胨　　　　　　 10g硫酸亞鐵　　　　　 0.2g硫代硫酸鈉　　　　 0.3g氯化鈉　　　　　　 5g瓊脂　　　　　　　 12g蒸餾水　　　　　　 1000mLpH7.4,2）制法,3）試驗方法,加熱溶解，校正pH，分裝試管，115℃高壓滅菌15min，取出直立候其凝固。,挑取瓊脂培養(yǎng)物，沿管壁穿刺，于36±1℃培養(yǎng)1～2d，觀察結(jié)果。產(chǎn)硫化氫者使培養(yǎng)基變?yōu)楹谏??！　∽ⅲ耗c桿菌

46、科細菌測定硫化氫的產(chǎn)生，應采用三糖鐵瓊脂或本培養(yǎng)基。,15、尿素瓊脂,1）成分,蛋白胨　　　　　　1g氯化鈉　　　　　　5g葡萄糖　　　　　　1g磷酸二氫鉀　　　　2g0.4%酚紅溶液　　 3mL瓊脂　　　　　　　20g蒸餾水　　　　　　1000mL20%尿素溶液　　　 100mLpH7.2±0.1,2）制法,將除尿素和瓊脂以外的成分配好，并校正pH，加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶。121℃高壓滅菌15min

47、。冷至50～55℃，加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，最終pH應為7.2±0.1。分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩?3）試驗方法,挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在36±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。,16、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基,1）成分,蛋白胨　　　　　 10g氯化鈉　　　　　 5g磷酸二氫鉀　　　 0.225g磷酸氫二鈉　　　 5.64g蒸餾水　　　

48、　　 1000mL0.5%氰化鉀溶液　 20mLpH7.6,2）制法,將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121℃高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100mL培養(yǎng)基加入0.5%氰化鉀溶液2.0mL(最后濃度為1∶10000)，分裝于12mm×100mm滅菌試管，每管約4mL，立刻用滅菌橡皮塞塞緊，放在4℃冰箱內(nèi)，至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，分裝試管備用。,3）試驗方法,將瓊

49、脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基。并另挑取1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在36±1℃培養(yǎng)1～2d，觀察結(jié)果。如有細菌生長即為陽性(不抑制)，經(jīng)2d細菌不生長為陰性(抑制)。,注：氰化鉀是劇毒藥物，使用時應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應在冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴，氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應。試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特

50、別注意。,17、硝酸鹽培養(yǎng)基,1）成分,硝酸鉀　　　　　　　　 0.2g蛋白胨　　　　　　　　 5g蒸餾水　　　　　　　　 1000mLpH7.4,2）制法,溶解，校正pH，分裝試管，每管約5mL，121℃高壓滅菌15min?！　∠跛猁}還原試劑　　甲液：將對氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中?！　∫乙海簩⒓纵涟?.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。,接種后在36±1℃培養(yǎng)1～

51、4d，加入甲液和乙液各一滴，觀察結(jié)果。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽時于立刻或數(shù)分鐘內(nèi)顯紅色。 　　注：本試驗陰性的原因有三：細菌不能還原硝酸鹽；亞硝酸鹽繼續(xù)分解，生成氨和氮；培養(yǎng)基不適于細菌的生長。如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否未被分解，可再加入鋅粉少許，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽而呈現(xiàn)紅色。,3）試驗方法,18、氧化酶試驗,1）試劑,1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液：少量新鮮配制，干冰箱內(nèi)避光保存。 1%α-萘酚－乙醇溶液。,2）試驗方法

52、,取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；再加α-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。　 以毛細吸管吸取試劑，直接滴加于菌落上，其顯色反應與以上相同。,19、細胞色素氧化酶試驗,1）試劑,1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液：少量新鮮配制，干冰箱內(nèi)避光保存。 1%α-萘酚－乙醇溶液。,2）試驗方法,取37℃(或低于37℃)培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種

53、試劑各2～3滴，從斜面上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培養(yǎng)物。如系平板培養(yǎng)物，則可用試劑混合液滴在菌落上。,3）結(jié)果,于2min內(nèi)呈現(xiàn)藍色者為陽性。陽性培養(yǎng)物大多數(shù)于半分鐘內(nèi)出現(xiàn)強陽性反應，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應均作為陰性結(jié)果。,20、過氧化氫酶試驗,1）試劑,3%過氧化氫溶液：臨用時配制。,2）試驗方法,挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2mL，觀察結(jié)果。,3）結(jié)果,于半分鐘

54、內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。,21、過氧化物酶試驗,1）試劑,2）試驗方法,2%兒茶酚溶液。3%過氧化氫溶液。,挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加2%兒茶酚溶液1mL及3%過氧化氫溶液1mL。靜置于室溫(20℃)中30～60min，觀察結(jié)果。,3）結(jié)果,陽性反應，細菌變?yōu)楹诤稚?；陰性反應，細菌不變色?！　∽ⅲ哼^氧化物酶的作用可受氰化鉀的抑制。,22、磷酸鹽緩沖液,1）儲存液,磷酸二氫鉀　　　　　　　　34

55、g1mol/L氫氧化鈉溶液　　　 175mL蒸餾水　　　　　　　　　　825mLpH7.2,2）制法,先將磷酸鹽溶解于500mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH后，再用蒸餾水稀釋至1000mL。,3）稀釋液,取儲存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。分裝每瓶100mL或每管10mL，121℃高壓滅菌15min。,23、明膠磷酸鹽緩沖液,1）成分,明膠　　　　　　　　　2g磷酸氫二鈉　　　　　　4g蒸餾水

56、　　　　　　　　1000mLpH6.2,2）制法,加熱溶解，校正pH，121℃高壓滅菌15min。,24、乳酸－苯酚溶液 （檢驗真菌形態(tài)用）,1）成分,2）制法,苯酚　　　　　　　　 10g乳酸(比重1.21)　　　　10g甘油　　　　　　　　 20g蒸餾水　　　　　　　 10mL,將苯酚在水中加熱溶解，然后加入乳酸及甘油。,25、肉浸液肉湯,1）成分,絞碎牛肉　　　　　　　500

57、g氯化鈉　　　　　　　　5g蛋白胨　　　　　　　　10g磷酸氫二鉀　　　　　　2g蒸餾水　　　　　　　　1000mL,2）制法,將絞碎之去筋膜無油脂牛肉500g加蒸餾水1000mL，混合后放冰箱過夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小時，使肉渣完全凝結(jié)成塊，用絨布過濾，并擠壓收集全部濾液，加水補足原量。加入蛋白胨、氯化鈉和磷酸鹽，溶解后校正pH7.4～7.6煮沸并過濾，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌30min。,26、肉浸液瓊脂,1）成分

58、,2）制法,肉浸液肉湯(PH7.4)　　 1000mL瓊脂　　　　　　　　 17～20g,加熱溶化瓊脂，分裝燒瓶或試管，121℃高壓滅菌30min。根據(jù)需要，傾注平板或放成斜面。,27、牛肉(或牛心)消化湯,1）成分,絞碎牛肉(或牛心)　　　 1000g15%氫氧化鈉溶液　　　27mL胰蛋白酶　　　　　　　40mL三氯甲烷　　　　　　　1mL氯化鈉　　　　　　　　10g蒸餾水　　　　　　　　2000mL,2）制法,① 稱

59、取碎牛肉，加蒸餾水，隔水加熱到80℃，維持15min?！　、?加氫氧化鈉溶液，對pH試紙呈弱堿性，冷至40℃?！　、?加胰蛋白酶、氯仿，在36±1℃放置4～5h，每小時搖動一二次?！　、?4h后，吸取上層液5mL于試管中，加5%硫酸銅溶液0.1mL、4%氫氧化鈉溶液5mL，混合之。若呈紅色，則不須再消化，可由溫箱取出。,⑤ 加入15%乙酸溶液45mL，對pH試紙呈酸性?！　、?煮沸15min，使胰蛋白酶破壞，冷后，放冰

60、箱內(nèi)一夜?！　、?次日吸取上層清液，加氯化鈉10g，并加水補足原量，煮沸?！　、?校正pH7.4～7.6(加15%氫氧化鈉溶液約10mL)，加熱，用濾紙過濾，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min。,注：①此培養(yǎng)基可作為瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，不需加蛋白胨。　?、谝鹊鞍酌钢渲疲悍Q取去脂絞碎的豬胰500g，加入乙醇500mL、蒸餾水1500mL，混合之，裝人玻塞瓶內(nèi)。每日搖勻三次。3d后，用絨布過濾擠出其汁，加鹽酸至0.05%，放冰箱內(nèi)

61、保存?zhèn)溆谩?28、血消化湯,1）成分,絞碎豬胃　　　　　100g絞碎豬血塊　　　　100g蒸餾水　　　　　　1000mL濃鹽酸　　　　　　10mL,2）制法,① 洗滌豬胃，除去油脂，保留胃粘膜，用絞肉機絞碎。② 用絞肉機將豬血塊絞碎。③ 將蒸餾水加熱至55℃，加入豬胃、豬血塊和鹽酸，置55℃水浴中24h，時常加以搖動。④ 從水浴內(nèi)取出，加入1moL/L碳酸鈉溶液5mL，煮沸10min，置于冰箱內(nèi)一夜。,⑤ 吸取上層清液，加磷

62、酸氫二鉀1g，加熱至75℃，加入1mol/L碳酸鈉溶液45mL，煮沸，校正pH7.2～7.4。⑥ 用濾紙過濾，分裝燒瓶，121℃高壓滅菌20min。,注：①本培養(yǎng)基不含糖可供作鑒別培養(yǎng)基之基礎(chǔ)，不需加蛋白胨和氯化鈉?！　、?mol/L碳酸鈉溶液之配法：無水碳酸鈉10.6g，溶于1000mL蒸餾水中。,29、豆粉瓊脂,1）成分,牛心消化湯(PH7.4～7.6)　　　　　1000mL瓊脂　　　　　　　　　　　　　 20g黃豆粉

63、浸液　　　　　　　　　　 50mL,將瓊脂加在牛心消化湯內(nèi)，加熱溶解，過濾。加入豌豆粉浸液，分裝每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min。豌豆粉浸液制法：取豌豆粉5g、氯化鈉10g，加入蒸餾水100mL。置100℃水浴內(nèi)加熱1h，放于冰箱中過夜。吸取上清液即為豌豆浸液。,2）制法,30、血瓊脂,1）成分,2）制法,pH7.4～7.6豆粉瓊脂　　　　　　100mL脫纖維羊血(或兔血)　　　　　　 5～10mL,加熱溶化瓊脂，冷

64、至50℃，以滅菌手續(xù)加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。亦可分裝滅菌試管，置成斜面。亦可用其他營養(yǎng)豐富的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制血瓊脂。,31、營養(yǎng)瓊脂,1）成分,蛋白胨　　　 10g牛肉膏　　　　3g 氯化鈉　　　　5g瓊脂　　　　　15～20g蒸餾水　　 1000mL,2）制法,將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.2～7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。分裝燒瓶，121℃高

65、壓滅菌15min?！　∽ⅲ捍伺囵B(yǎng)基可供一般細菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面。如用于菌落計數(shù)，瓊脂量為1.5%；如作成平板或斜面，則應為2%。,32、營養(yǎng)肉湯,1）成分,2）制法,蛋白陳　　　　10g牛肉膏　　　　3g氯化鈉　　　　5g蒸餾水　　　　1000mLpH7.4,按上述成分混合，溶解后校正pH，分裝燒瓶，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。,33、乳糖膽鹽發(fā)酵管,1）成分,蛋白胨　　　　　　　　　　20g

66、豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)　　　 5g乳糖　　　　　　　　　　　10g0.04%滇甲酚紫水溶液　　　 25mL蒸餾水　　　　　　　　　　1000mLpH7.4,2）制法,將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管10mL，并放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。,34、乳糖發(fā)酵管,1）成分,蛋白胨　　　　　　　　　　20g乳糖　　　　　　　　　　　10g0

67、.04%溴甲酚紫水溶液　　　 25mL蒸餾水　　　　　　　　　　1000mLpH7.4,2）制法,將蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，按檢驗要求分裝30mL、10mL或3mL，并放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。注：①雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍?！　、?0mL和10mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證實試驗用。,35、EC肉湯,1）成分,胰蛋白胨　　　　　　　　20g

68、3號膽鹽(或混合膽鹽)　　 1.5g乳糖　　　　　　　　　　5g磷酸氫二鉀　　　　　　　4g磷酸二氫鉀　　　　　　　1.5g氯化鈉　　　　　　　　　5g蒸餾水　　　　　　　　　1000mL,2）制法,將上述成分混合，溶解后，分裝有發(fā)酵倒管的試管中，121℃高壓滅菌15min，最終pH為6.9±0.2。,36、緩沖蛋白胨水(BP),1）成分,蛋白胨　　　　　　　　　　　　10g氯化鈉　　　　　　　　　　　　5g

69、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)　　9g磷酸二氫鉀　　　　　　　　　 1.5g蒸餾水　　　　　　　　　　　　1000mLpH7.2,2）制法,按上述成分配好后以大燒瓶裝，121℃高壓滅菌15min。臨用時無菌分裝每瓶225mL。注：本培養(yǎng)基供沙門氏菌前增菌用。,37、氯化鎂孔雀綠增菌液(MM),1）成分,甲液　　胰蛋白胨　　　　　　5g　　氯化鈉　　　　　　　8g　　磷酸二氫鉀　　　　　1.6g