蘭州熊蜂雌性蜂蛋白質(zhì)組與MicroRNA分析.pdf

1、蘭州熊蜂(Bombus lantschouensis)以其群勢大、易飼養(yǎng)和授粉性能優(yōu)良等優(yōu)點成為我國重點繁育和推廣的本土熊蜂。蜂王產(chǎn)卵對于整個蜂群的建立和發(fā)展起決定性的作用，關(guān)系到熊蜂繁育的成敗，然而，生產(chǎn)中往往出現(xiàn)蜂王不明原因的不產(chǎn)卵現(xiàn)象。因此，本文詳細(xì)闡述了影響熊蜂雌性蜂產(chǎn)卵的因素，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，分析蘭州熊蜂產(chǎn)卵與未產(chǎn)卵雌性蜂血淋巴蛋白質(zhì)的差異;通過高通量測序技術(shù)對產(chǎn)卵與未產(chǎn)卵蜂王卵巢MicroRNA進(jìn)行預(yù)測和差異分析，最

2、后，對兩個主要候選蛋白進(jìn)行了基因克隆與表達(dá)分析，主要取得如下結(jié)果:
　　1.蘭州熊蜂雌性蜂血淋巴蛋白質(zhì)組研究
　　本研究采用凝膠電泳技術(shù)（2-DE）和GeLC-MS/MS兩種蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，對蘭州熊蜂產(chǎn)卵與未產(chǎn)卵蜂王和工蜂血淋巴進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:血淋巴總蛋白濃度可以作為判斷雌性蜂產(chǎn)卵的標(biāo)志;獲得蘭州熊蜂雌性蜂產(chǎn)卵與未產(chǎn)卵狀態(tài)血淋巴蛋白質(zhì)的表達(dá)譜。通過LC-MS/MS鑒定蛋白未產(chǎn)卵蜂王275個，產(chǎn)卵蜂王314個，未產(chǎn)卵工

3、蜂783個和產(chǎn)卵工蜂463個;其中，雌性蜂共同表達(dá)的蛋白數(shù)量為128個，差異表達(dá)蛋白數(shù)量為44個;通過GO分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵前后蜂王和工蜂的血淋巴蛋白質(zhì)功能組成發(fā)生了明顯的改變，雌性蜂產(chǎn)卵后，富集于生殖過程、行為以及一些分子功能及細(xì)胞組成的蛋白增多，富集于應(yīng)對刺激反應(yīng)和一些細(xì)胞代謝氧化功能的蛋白減少。
　　2.蘭州熊蜂蜂王卵巢microRNA研究
　　利用rnirDeep2對蘭州熊蜂蜂王卵巢組織進(jìn)行miRNA預(yù)測，共獲得329個

4、已知miRNA，其中有75個是蜜蜂已知的成熟miRNA;利用地熊蜂基因組進(jìn)行比對和預(yù)測，共獲得255個新的蘭州熊蜂成熟miRNA。通過miRNA表達(dá)差異性分析，發(fā)現(xiàn)所有表達(dá)差異顯著的miRNA中，表達(dá)趨勢均是產(chǎn)卵后下調(diào)。利用4種算法篩選適合蘭州熊蜂蜂王miRNA表達(dá)分析的內(nèi)參基因，結(jié)果表明:miR275是蘭州熊蜂蜂王不同生殖狀態(tài)下頭部和卵巢組織中表達(dá)水平最穩(wěn)定的基因;在不同組織中，miR277是卵巢中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而miR275

5、是頭部中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　3.蘭州熊蜂IRP30基因克隆及表達(dá)分析
　　通過RACE和降落PCR技術(shù)克隆了蘭州熊蜂IRP30基因的cDNA全長，結(jié)果表明:蘭州熊蜂IRP30基因共有一個轉(zhuǎn)錄本，其全長為1082bp，編碼區(qū)序列(CDS)長度為825bp，共編碼275個氨基酸，N端具有信號肽序列。通過保守結(jié)構(gòu)域分析表明，IRP30在35-180個氨基酸之間具有多個富亮氨酸重復(fù)區(qū)。通過熒光定量的方法分析表明，IRP30在

6、Pb（棕眼）和Pb1（棕眼體表淺著色）蛹期時，表達(dá)量極顯著高于其他時期(p＜0.01); IRP30表達(dá)量變化規(guī)律，在三型蜂之間為:工蜂＞蜂王＞雄性蜂，在不同組織間為:胸部＞頭部＞腹部，其中，在頭、肌肉和脂肪體中的相對表達(dá)量較高。通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)分析表明，與未產(chǎn)卵狀態(tài)相比，雌性蜂產(chǎn)卵后IRP30的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均極顯著上調(diào)(p＜0.01)，推測該蛋白參與雌性蜂生殖轉(zhuǎn)變過程。
　　4.蘭州熊蜂PEBP基因克隆及表

7、達(dá)分析
　　利用RACE技術(shù)克隆了蘭州熊蜂PEBP基因的cDNA全長，結(jié)果表明:PEBP基因全長為1217bp，共有2個轉(zhuǎn)錄本PEBPX1和PEBPX2，其全長分別為1005 bp和915 bp，編碼區(qū)序列(CDS)長度分別為627 bp和549 bp，共編碼208和182個氨基酸，其中，PEBPX1的N端具有信號肽序列，PEBPX2不含信號肽序列。通過采用絕對熒光定量PCR分析表明，在卵、Pb1和Pbd蛹期，PEBP兩個轉(zhuǎn)錄本的

8、表達(dá)量均極顯著高于其他時期(p＜0.01)，除Pha（預(yù)成蟲）期外，PEBPX2的表達(dá)量均顯著高于PEBPX1(p＜0.05)，表明熊蜂不同發(fā)育時期對PEBPX2的偏好性更強(qiáng)。通過絕對熒光定量和蛋白免疫印跡分析表明，蘭州熊蜂蜂王和工蜂由未產(chǎn)卵狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)卵狀態(tài)后，PEBP的mRNA表達(dá)量極顯著升高(p＜0.01)，且PEBPX2的表達(dá)量高于PEBPX1，在蛋白水平也具有相同的趨勢，推測該蛋白參與熊蜂雌性蜂的生殖過程。
　　綜上所述