未折疊蛋白反應(yīng)在增強(qiáng)口腔鱗癌藥物治療敏感性中的作用.pdf

1、目的：
　　1.探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78在口腔鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后間的關(guān)系。
　　2.探討口腔鱗癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78表達(dá)的關(guān)系。
　　方法：
　　1.統(tǒng)計學(xué)分析GRP78的表達(dá)與口腔鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系；
　　2. MTT法探討奧沙利鉑、衣酶素以及二者合用24、48、72 h后對人口腔鱗癌KB細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系；<

2、br>　　3.集落克隆法探討奧沙利鉑、衣酶素單獨(dú)及聯(lián)合使用對人口腔鱗癌 KB細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用；
　　4. PI單染，檢測奧沙利鉑、衣酶素以及二者合處理人口腔鱗癌細(xì)胞KB24 h后對誘導(dǎo)人口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的影響；
　　5. Western blot法探討奧沙利鉑、衣酶素以及二者合用處理人口腔鱗癌細(xì)胞KB24 h后對人口腔鱗癌細(xì)胞KB GRP78、Caspase-12表達(dá)的影響；
　　6. Caspase-3活性

3、試劑盒檢測Caspae-3活性；
　　7. siRNA法下調(diào)GRP78后，Western blot法檢測口腔鱗癌細(xì)胞中GRP78蛋白的表達(dá)，PI單染檢測下調(diào)GRP78后奧沙利鉑對人口腔鱗癌細(xì)胞KB凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　一、GRP78在口腔鱗癌患者組織中的表達(dá)與臨床病理特征、預(yù)后關(guān)系的相關(guān)性
　　1. GRP78和口腔鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系
　　GRP78的陽性表達(dá)與患者的腫瘤直徑、腫瘤大小、淋

4、巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分化程度等因素有關(guān)且具有統(tǒng)計學(xué)意義。GRP78的表達(dá)與年齡、性別、抽煙、飲酒等因素?zé)o關(guān)。
　　2. GRP78陽性表達(dá)的患者預(yù)后的存活率低于GRP78陰性表達(dá)的患者。
　　3. Cox模型分析年齡、遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移、GRP78陽性表達(dá)是影響口腔鱗癌患者生存期的風(fēng)險因子。
　　二、衣霉素聯(lián)合奧沙利鉑對人口腔鱗癌KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　1.衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑對人口腔鱗癌KB細(xì)胞增殖

5、的抑制作用
　　衣霉素單獨(dú)作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞24、48、72 h后，口腔鱗癌KB細(xì)胞存活率為90.37％、89.44%、88.91%；奧沙利鉑單獨(dú)作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞24、48、72 h后，口腔鱗癌KB細(xì)胞存活率分別為62.36%、47.54%、40.47%。衣霉素與奧沙利鉑聯(lián)合使用作用與人口腔鱗癌KB細(xì)胞24、48、72 h后，口腔鱗癌KB細(xì)胞的存活率為50.78%、37.77%、23.24%，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0

6、.05，見圖1)。
　　2.衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑對人口腔鱗癌KB細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用
　　0.25μmol/L衣霉素、0.125μmol/L奧沙利鉑單獨(dú)以及聯(lián)合使用作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞，結(jié)果表明，衣霉素在低濃度即可明顯抑制人口腔鱗癌KB細(xì)胞的集落克隆形成，聯(lián)合使用時可提高奧沙利鉑對人口腔鱗癌KB細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用。
　　3.衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔鱗癌KB細(xì)胞凋亡的作用
　　0.5μmol/L

7、衣霉素作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞48 h后，人口腔鱗癌KB細(xì)胞的凋亡率為8.3%。0.25μmol/L奧沙利鉑作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞48 h后，人口腔鱗癌KB細(xì)胞凋亡率為12.2%。0.5μmol/L衣霉素與0.25μmol/L奧沙利鉑聯(lián)合作用于人口腔鱗癌 KB細(xì)胞48 h后，誘導(dǎo)人口腔鱗癌 KB細(xì)胞的凋亡率為26.2%。
　　4.衣霉素增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔鱗癌KB細(xì)胞的Caspase-3激活作用
　　低濃度衣霉素作用人口腔

8、鱗癌KB細(xì)胞后， Caspase-3的活性并未出現(xiàn)明顯提高，但衣霉素與奧沙利鉑聯(lián)合使用時可明顯提高奧沙利鉑對人口腔鱗癌KB細(xì)胞Caspase-3的激活作用。
　　5.衣霉素可提高奧沙利鉑誘導(dǎo)的人口腔鱗癌 KB細(xì)胞的GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白的表達(dá)
　　衣霉素可誘導(dǎo)人口腔鱗癌KB細(xì)胞GRP-78的表達(dá)，衣霉素聯(lián)合奧沙利鉑作用于人口腔鱗癌KB細(xì)胞后，可誘導(dǎo)GRP-78更強(qiáng)烈的的表達(dá)。衣霉素、奧沙利鉑

9、聯(lián)合使用使得Caspase-12、Caspase-3蛋白的表達(dá)高于單獨(dú)用藥組。
　　三、下調(diào)GRP78具有增強(qiáng)奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的敏感性
　　1.SiRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測
　　將不同序列的siRNA-GRP78和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入口腔鱗癌細(xì)胞 KB中，用Western blot法檢測了口腔鱗癌細(xì)胞KB中 GRP78的表達(dá)，與對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-GRP78組中GRP78表達(dá)明顯降低。
　　2

10、.SiRNA轉(zhuǎn)染對奧沙利鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增敏作用
　　將口腔鱗癌細(xì)胞 KB進(jìn)行轉(zhuǎn)染下調(diào) GRP78后，奧沙利鉑對口腔鱗癌細(xì)胞 KB凋亡率明顯升高，與單用奧沙利鉑組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.口腔鱗癌組織中GRP78在蛋白水平上的表達(dá)量明顯高于其在正常組織中的表達(dá)量
　　2.口腔鱗癌組織中GRP78在蛋白水平上的表達(dá)量與臨床病理特征、預(yù)后情況存在相關(guān)性，可以作為一個潛在口腔鱗癌癥標(biāo)記物用