低轉(zhuǎn)染效率細胞同源重組效率的檢測.pdf

1、基因組編輯技術(shù)是利用人工核酸內(nèi)切酶對特定的目的基因進行修飾和改造，引入DNA片段或造成目的基因缺失的一種技術(shù)。目前應(yīng)用最廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠?qū)δ康幕蜻M行高效快捷地改造，實現(xiàn)目的基因的敲入或者敲除，從而定向改變物種的遺傳信息。該技術(shù)主要應(yīng)用到探究物種基因的功能及作用機理、構(gòu)建模式動物、基因治療等方面。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用到靶位點上會導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致細胞啟動同源重組修復(fù)（HDR）或者非同源末端連

2、接修復(fù)（NHEJ）。非同源末端連接修復(fù)可以引起堿基移碼突變，實現(xiàn)基因沉默；而同源重組修復(fù)可以實現(xiàn)基因的定向改造。大多數(shù)情況下，為了提高實驗成功率，在使用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因定向改造前，需要篩選出高效的靶位點。如今，基因組編輯效率的檢測手段有很多種，主要是檢測NHEJ效率，而很少有檢測HDR效率，但是在很多研究中，對基因組進行修飾主要用的是同源重組修復(fù)途徑。
　　本研究致力于HDR效率的檢測。選取小鼠母源印記Meg3基因

3、作為研究對象，確定該基因位置的10個gRNA位點，用兩種細胞系作為受體細胞來檢測10個位點同源重組效率。一種是容易培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的293T細胞系，首先將小鼠Meg3基因的3'和5'大小約3kb左右DNA序列擴增出來，然后導(dǎo)入293T細胞的基因組中，以該細胞系作為平臺，利用改良后的擴增片段酶切分析（AFDA）檢測方法檢測10個位點同源重組效率；另一種是小鼠ES細胞，由于ES細胞轉(zhuǎn)染難度大，本課題通過摸索優(yōu)化ES細胞轉(zhuǎn)染條件，最終確定利用電轉(zhuǎn)染

4、法，電轉(zhuǎn)程序為 A-013，轉(zhuǎn)染細胞數(shù)量滿足2-4×106個，轉(zhuǎn)染效率能都達到10％-20%，由于該效率還不能達到后續(xù)檢測要求，我們在Cas9質(zhì)粒中引入一段綠色熒光蛋白基因，能隨Cas9蛋白一起表達而不影響Cas9蛋白作用，然后利用流式細胞儀分選出帶綠色熒光的細胞，剔除未轉(zhuǎn)染成功的細胞，間接提高轉(zhuǎn)染效率，最終ES細胞樣品轉(zhuǎn)染效率相當于達到90%，同樣利用擴增片段酶切分析檢測方法檢測10個位點的同源重組效率。利用容易培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染的293T細

5、胞為受體細胞檢測出小鼠Meg3基因10個位點的同源重組效率，篩選出3'-1和5'-4高效率位點，但是293T細胞中的基因環(huán)境與小鼠細胞中的基因環(huán)境有所不同，可能導(dǎo)致每個靶位點的同源重組效率也會不同，我們又用 ES細胞為受體細胞同樣檢測這10個位點的同源重組效率，得到結(jié)果也是3'-1和5'-4兩個位點效率最高，而且兩批結(jié)果其他靶位點效率高低也基本一致，說明293T細胞基礎(chǔ)上檢測的結(jié)果是可靠的。本實驗創(chuàng)造性建立了一種利用易培養(yǎng)易轉(zhuǎn)染細胞系檢