Trps1負(fù)向調(diào)控EMT對(duì)移植肝膽管纖維化的影響.pdf

1、一.背景:
　　非吻合口膽管狹窄(nonanastomotic biliary strictures,NABS)是目前肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要類(lèi)型,可導(dǎo)致進(jìn)行性膽汁性肝硬化、移植物失功、再次肝移植及死亡,是制約肝移植療效進(jìn)一步提高的瓶頸。其病理基礎(chǔ)是膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cell,BEC)損傷后局部異常修復(fù)所致的移植肝膽管纖維化。研究發(fā)現(xiàn),移植肝膽管纖維化發(fā)生的獨(dú)立影響因素是冷保存再灌注損傷(col

2、d preservation reperfusion injury,CPRI),但其發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
　　既往有關(guān)CPRI致移植肝膽管纖維化機(jī)制的研究主要側(cè)重于TGF-1誘導(dǎo)的肝星形細(xì)胞活化這一固有途徑。新近研究證實(shí),BEC在細(xì)胞因子/促炎因子刺激下可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)為成纖維細(xì)胞,是肝膽道纖維化過(guò)程中基質(zhì)生成細(xì)胞的主要異質(zhì)性來(lái)源。我們前期研究發(fā)

3、現(xiàn),BEC EMT是肝移植術(shù)后膽道纖維化狹窄的重要因素,提示若在BEC EMT這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù),有可能抑制或逆轉(zhuǎn)移植肝膽管纖維化的進(jìn)程。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化/間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition/mesenchymal-epithelial transition,EMT/MET)的平衡決定了創(chuàng)傷、炎癥組織修復(fù)的轉(zhuǎn)歸和結(jié)局,如果EMT發(fā)揮主要作用,修復(fù)將以纖維化告終,反之,纖維化可逆

4、轉(zhuǎn)為正常上皮。因此,通過(guò)抑制EMT、促進(jìn)MET來(lái)減輕或逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷、炎癥組織的纖維化,已成為抗纖維化研究新的靶點(diǎn)。發(fā)鼻指(趾)綜合征1型相關(guān)基因(trichorhinophalangeal syndrome type1,Trps1)是胚胎期間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要調(diào)控因子,對(duì)多種細(xì)胞EMT起關(guān)鍵的負(fù)向調(diào)控作用,而創(chuàng)傷、炎癥組織的修復(fù)過(guò)程是胚胎期多種上皮組織發(fā)育過(guò)程的再現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道Trps1在負(fù)向調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞EMT

5、及腎臟、肺纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其是否參與了移植肝膽管CPRI損傷后修復(fù)過(guò)程及其可能的機(jī)制目前尚不清楚。
　　二.目的:
　　通過(guò)檢測(cè)肝移植術(shù)后NABS患者病肝標(biāo)本,離體和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Trps1參與肝移植術(shù)后NABS發(fā)生,通過(guò)對(duì)BEC EMT過(guò)程的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控作用,進(jìn)而抑制移植肝膽管纖維化的進(jìn)程。本研究有望拓寬對(duì)移植肝膽管纖維化發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí),為臨床肝移植術(shù)后NABS的防治提供新的策略,也將為損傷性膽管狹窄、肝膽管結(jié)石

6、病等相關(guān)疾病的理論研究和臨床診治提供新的線索。
　　三.方法和結(jié)果:
　　第一部分:NABS病肝標(biāo)本中Trps1、上皮及間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)
　　采集肝移植術(shù)后NABS患者二次肝移植病肝標(biāo)本6例,免疫組化方法檢測(cè)Trps1及上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)、間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)蛋白在BEC中的表達(dá);Masson三色染色檢測(cè)膽管周?chē)z原沉積。免疫組化及Masson染色結(jié)果均進(jìn)行半定量分析。用肝

7、臟海綿狀血管瘤瘤體周邊正常肝膽管組織進(jìn)行對(duì)照。采用直線回歸分析評(píng)估:(1)移植肝膽管Trps1與上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)、間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)表達(dá)水平相關(guān)性;(2)移植肝膽管纖維化程度與Trps1蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　NABS組標(biāo)本中BEC Trps1、上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)表達(dá)下調(diào)或缺失,間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)異常陽(yáng)性表達(dá),膽管周?chē)罅磕z原

8、沉積;而對(duì)照組中上BEC Trps1、上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)正常表達(dá),間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)陰性,膽管周?chē)鷥H見(jiàn)少量膠原沉積。免疫組織化學(xué)半定量分析顯示上述各種標(biāo)志物在兩組中的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。Mssson染色結(jié)果半定量分析顯示兩組標(biāo)本膽管周?chē)z原沉積水平差異顯著(P<0.05)。直線回歸分析顯示,Trps1與上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)表達(dá)正相關(guān)(P<0.05),

9、而與間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)表達(dá)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。移植肝膽管纖維化程度與Trps1表達(dá)水平負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　第二部分:離體實(shí)驗(yàn):Trps1在體外模擬CPRI誘導(dǎo)培養(yǎng)的HIBEC EMT中的作用
　　采用體外模擬 CPRI的方法處理人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(human intrahepatic biliary epithelial cells,HIBECs P5100),電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),劃痕試

10、驗(yàn)比較細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力, PCR檢測(cè)Trps1、上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)與間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA) mRNA表達(dá)水平并做相關(guān)分析,Western blotting檢測(cè)上述標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平。分別利用Trps1腺病毒及Trps1 siRNA轉(zhuǎn)染HIBEC上調(diào)或下調(diào)內(nèi)源性Trps1表達(dá),重復(fù)CPRI誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),PCR及Western blotting檢測(cè)上皮標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物Vimenti

11、n mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　體外模擬CPRI處理HIBEC后,細(xì)胞形態(tài)由卵圓石樣或多邊形變?yōu)樗笮尉佣嗟某衫w維細(xì)胞樣,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)。上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表達(dá)減少(P<0.05),而間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達(dá)增加(P<0.05),BEC發(fā)生EMT。直線回歸分析顯示在此過(guò)程中Trps1 mRNA與上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK1

12、9)mRNA表達(dá)正相關(guān)(P<0.05),而與間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表達(dá)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。Trps1腺病毒轉(zhuǎn)染HIBEC后,細(xì)胞內(nèi)Trps1 mRNA表達(dá)升高,重復(fù)上述CPRI誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),EMT效應(yīng)被抑制; Trps1 siRNA轉(zhuǎn)染HIBEC后,細(xì)胞

13、內(nèi)Trps1 mRNA表達(dá)降低,重復(fù)上述CPRI誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),上皮標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05),EMT效應(yīng)加強(qiáng)。
　　第三部分:在體實(shí)驗(yàn):Trps1在SD大鼠原位肝移植術(shù)后膽管細(xì)胞EMT中的作用
　　建立重建肝動(dòng)脈血供的SD大鼠原位肝移植模型,冷保存時(shí)間選擇1h、6h、12h,術(shù)后選擇1d、3d、7d、

14、14d四個(gè)時(shí)相點(diǎn),采用Real-Time PCR定量檢測(cè)大鼠移植肝膽管Trps1、上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)與間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表達(dá)水平,Western blotting檢測(cè)Trps1、上皮標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin蛋白表達(dá)水平。
　　隨著供體肝臟冷保存時(shí)間延長(zhǎng),Trps1 mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05),上皮標(biāo)志物(E-cadherin、C

15、K19)mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05)、間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)。隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng),移植肝膽管上皮標(biāo)志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表達(dá)逐漸降低(P<0.05),間質(zhì)標(biāo)志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達(dá)逐漸升高(P<0.05)。而Trps1表達(dá)先下調(diào)后上調(diào),表現(xiàn)為術(shù)后1d Trps1 mRNA及蛋白表達(dá)降低,3d開(kāi)始升高,至1

16、4d達(dá)到峰值。
　　四.結(jié)論:
　　1.Trps1參與肝移植術(shù)后NABS發(fā)病過(guò)程,并與BEC EMT及移植肝膽管纖維化負(fù)相關(guān)。
　　2.體外模擬CPRI可誘導(dǎo)HIBEC發(fā)生EMT,Trps1參與調(diào)控HIBEC EMT,發(fā)揮重要的拮抗作用并可能逆轉(zhuǎn)該過(guò)程。
　　3.SD大鼠肝移植術(shù)后,CPRI引起Trps1表達(dá)下調(diào),進(jìn)而誘導(dǎo)BEC發(fā)生EMT,在動(dòng)物疾病模型上進(jìn)一步證實(shí)Trps1是BEC EMT的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)控因子。<