NOS抑制劑對METH神經(jīng)毒性的保護作用及GSTP1過表達載體的構建.pdf

1、背景:
　　 近年來，新型毒品種類不斷增多，為毒品的防治提出新的課題和挑戰(zhàn)。甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH or MA)俗稱“冰毒”，屬于苯丙胺類興奮劑，是最具代表性的和最常見新型毒品。因其具有見效快、興奮作用維持時間長，價格低廉，化學合成技術簡單，多途徑攝取等特點，使它濫用及蔓延速度極快，成為當今我國危害最為嚴重和濫用的兩大毒品之一。
　　 法醫(yī)在接觸因吸食冰毒死亡或與吸毒有關的其它暴力死亡的尸檢

2、和在戒毒所治療的病人過程中，發(fā)現(xiàn)其死亡與心腦重要器官及其血管的代謝損傷相關。有大量的資料表明，冰毒對大腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生直接的損害作用，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)化學、神經(jīng)病理改變，導致神經(jīng)細胞變性、壞死和異常的膜性結構改變，出現(xiàn)急性和慢性精神障礙和行為改變;可以導致心肌細胞肥大、萎縮、變性、收縮帶壞死、小血管內皮細胞損傷和小血管痙攣，從而導致急性心肌缺血、心肌病和心律失常，成為吸毒者突然死亡的原因。因此，對冰毒吸食者毒性損傷機制乃至成癮機制及猝

3、死機制的研究和探索成為國內外法醫(yī)關注的問題，也是本實驗室近十年來的重點研究方向。
　　 目前，關于METH的神經(jīng)毒性機制國內外研究結果尚未完全明確，現(xiàn)階段的研究結果顯示多種機制參與了METH的神經(jīng)毒性，主要包括氧化應激、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等，其中氧化應激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要機制作用之一。
　　 本實驗室運用蛋白質組學的方法，對METH注射后大鼠紋狀體、額葉皮質、海馬等部位的差異表達蛋白質進

4、行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型的NO合成調節(jié)酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)表達上調，提出了DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)可能是NO過表達引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要途徑。本課題組前期研究應用穩(wěn)定同位素標記氨基酸細胞培養(yǎng)技術(SILAC)，對METH作用后PC12細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉移酶蛋白(GSTP1)硝基化增強，提出了GSTP1-P35/P25-CdK5可能是氧化應激損傷的重要調節(jié)途徑。
　　 本研究

5、擬建立METH中毒細胞模型和動物模型，通過形態(tài)學、NOS含量、DA含量及凋亡等指標的檢測，進一步驗證METH引起的中樞性毒害作用，并通過給予NOS抑制劑（L-NAME和7-NI）反證氧化應激過程中NOS在METH中毒模型中的作用及其與METH神經(jīng)毒性的關系，進一步完善DDAH1/ADMA/NOS通路的神經(jīng)毒性作用機制，并為研究GSTP1-P35/P25-CDK5這一可能的NO氧化應激下游通路的提供依據(jù)。
　　 本研究擬利用體外研

6、究手段，通過腺病毒載體在PC12細胞上建立GSTP1過表達模型，通過調控GSTP1表達，研究其基因水平的改變對METH氧化應激過程中上述通路的調控變化及作用，探索其是否是介導氧化應激致細胞骨架結構損傷和細胞凋亡死亡通路的中間環(huán)節(jié)。本研究預期結果不僅為闡明METH的毒性損傷作用機制提供基礎，也為METH中毒的防治、METH戒毒藥物靶點的選擇乃至為毒品戒斷治療奠定基礎。
　　 本研究還將應用mRNA表達譜芯片技術，檢測METH作用P

7、C12細胞引起的全基因mRNA的變化，以期篩選出差異表達mRNA，以明確差異表達mRNA和METH神經(jīng)毒性之間的關系，為今后的METH神經(jīng)毒性機制研究提供新的研究靶點。
　　 目的:
　　 建立METH中毒細胞模型和動物模型，并給予NOS抑制劑，通過形態(tài)學、NOS含量、DA含量及凋亡等指標的檢測，驗證氧化應激過程中NOS的作用及其與METH神經(jīng)毒性的關系;通過腺病毒載體在PC12細胞上建立GSTP1過表達模型，進而研究G

8、STP1在METH氧化應激過程中的作用;應用mRNA表達譜芯片技術，明確差異表達mRNA和METH神經(jīng)毒性之間的關系，為METH神經(jīng)毒性機制研究提供新的研究靶點。
　　 方法:
　　 1.METH中毒模型的建立及NO抑制劑的保護作用
　　 1.1 METH中毒動物模型的建立及7-NI的保護作用SD大鼠雄性24只，隨機分為四組，每組6只:生理鹽水組、METH組、METH+7-NI組、7-NI組。動物單籠飼養(yǎng)，自由飲

9、水、取食。實驗前先在飼養(yǎng)室適應3天。第一組（生理鹽水組）:腹腔注射生理鹽水，早8:30、晚5:00各一次，連續(xù)注射3天;第二組（METH組）:腹腔注射METH，早8:30、晚5:00各一次，連續(xù)注射3天;第三組（METH+7-NI組）:注射方法同第二組，提前30min在腹腔注射7-NI;第四組（7-NI組）:注射方法同第一組，提前30 min腹腔注射7-NI，腹腔注射生理鹽水。制成動物模型后，觀察行為學變化情況，對大鼠的刻板行為進行評分

10、。應用western blot檢測大鼠紋狀體nNOS表達、ELISA法檢測紋狀體多巴胺含量、應用Tunel熒光法檢測細胞凋亡。
　　 1.2 METH中毒細胞模型的建立及L-NAME的保護作用已分化的PC12細胞培養(yǎng)于含10％FBS、雙抗(1∶100)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PC12細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，達約80％匯合時進行實驗。實驗分為空白對照組（陰性對照）和實驗組，實驗組根據(jù)L-NAME(N

11、-硝基-L-精氨酸甲酯)濃度的不同而分為5組，各組METH含量均為2.0 mmol/L，L-NAME含量分別為0μmol/L（陽性對照）、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。當細胞生長至80％匯合時，倒去原培養(yǎng)液，實驗組加入含上述濃度METH和L-NAME的無血清培養(yǎng)基，對照組換成等體積不含血清和METH的培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后。倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態(tài)改變，PE Annexin試劑盒、

12、流式細胞術檢測細胞凋亡率，NOS檢測試劑盒檢測細胞總NOS活力，Western blot技術檢測GSTP1表達變化。
　　 2.GSTP1過表達載體的構建首先通過PCR擴增大鼠全長GSTP1 cDNA序列，然后將PCR產(chǎn)物與pshuttle-IRES-hrGFP-1體外重組并轉化大腸桿菌，測序驗證。然后又將穿梭質粒pshuttle-GSTP1與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1重組。通過Lipo2000介導將重組體腺病毒在AD29

13、3細胞中的包裝擴增。最后通過qPCR和western blotting驗證轉染效率。
　　 3.PC12細胞METH毒性損傷mRNA表達譜的差異分析及驗證按照前述方法進行培養(yǎng)PC12細胞并進行藥物處理，實驗分為空白對照組（陰性對照）和METH組，METH+L-NAME組。METH濃度為2.0mmol/L，L-NAME濃度100μmol/L當細胞生長至80％匯合時，倒去原培養(yǎng)液，實驗組加入含上述濃度METH和L-NAME的無血清培

14、養(yǎng)基，對照組換成等體積不含血清和METH的培養(yǎng)基，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后。將待檢樣品抽提RNA后進行mRNA表達譜芯片檢測。
　　 結果:
　　 1.METH中毒模型的建立及NO抑制劑的保護作用
　　 1.1 動物模型的建立及7-NI的保護作用本實驗METH組和7Ni+METH組的動物刻板行為評分均顯著高于7Ni和Control組（P均＜0.001），METH、7Ni+METH組間無顯著性差別(P=0.769)，7

15、Ni、Control組間無顯著性差別(P=0.190)。Western blot結果顯示METH組大鼠紋狀體中nNOS蛋白表達水平明顯升高，而METH+7-NI組nNOS表達水平較METH組明顯降低。ELISA結果顯示METH組DA顯著降低(P＜0.001)，而METH+L-NAME組、L-NAME組與對照組比較，DA無顯著差異(P＞0.01)。采用Tunel法檢測各組大鼠腦組織紋狀體內神經(jīng)細胞凋亡情況，METH組與對照組相比凋亡細胞數(shù)

16、顯著升高(P＜0.001)，而7-NI對凋亡的增高表現(xiàn)出明顯的保護作用（與METH組相比P＜0.001）。
　　 1.2 細胞模型的建立及L-NAME的保護作用結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組細胞相比，METH處理的細胞萎縮變圓，變圓細胞的胞質透亮度增加，可見環(huán)形透亮區(qū)，突起變短、斷裂、消失，神經(jīng)網(wǎng)絡結構消失，因細胞突起萎縮可在細胞表面形成毛刺狀，邊界不清晰。加入L-NAME處理后，細胞形態(tài)學改變隨濃度升高損傷呈減弱趨勢，中、高濃度處理主要

17、主要以胞體變圓及胞漿透亮增加為主，突起無明顯改變。METH處理后細胞凋亡率顯著增加，加入L-NAME后細胞總凋亡率隨著濃度增加逐漸減少，各實驗組與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)，尤其是中、高濃度L-NAME具有顯著的抑制細胞凋亡作用。METH作用后PC12細胞內總NOS活性增加，加入L-NAME后NOS活力逐漸下降，各實驗組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.02)。同時采用western-blot技術對細胞內GSTP1表達變

18、化進行檢測，發(fā)現(xiàn)單獨METH處理PC12細胞GSTP1水平顯著下降，加入L-NAME后對GSPT1蛋白的下降趨勢可起到明顯的抑制作用:隨L-NAME濃度的升高，GSTP1蛋白的表達逐漸上升，并出現(xiàn)接近正常水平的趨勢。
　　 2.GSTP1過表達載體的構建本實驗通過脂糖凝膠電泳跑膠，證明了攜帶GSTP1序列穿梭載體構建成功，在Ad-293細胞中觀察到綠色熒光的表達證明病毒在細胞內進行包裝，綠色熒光在PC12細胞中大面積的出現(xiàn)，顯示

19、pAdEasy-1重組腺病毒在PC12細胞中成功表達。qPCR以及western blotting的結果顯示腺病毒骨架質粒pAdEasy-1重組的轉染效率高。
　　 3.METH作用下大鼠腦組織mRNA表達譜的差異分析本實驗通過9張芯片比較正常對照組與METH組、METH+L-NAME組三組間的差異表達mRNA，結果表明METH可導致184個基因表達上調，518個基因表達下調;而NOS抑制劑L-NAME可對其中的470下調基因和

20、2個上調基因發(fā)生有效的保護作用，約占全部差異基因的67.24％。METH組與正常對照組之間差異表達的基因中，我們發(fā)現(xiàn)與凋亡相關的基因有16個。
　　 結論:
　　 1.在大鼠動物模型上，METH明顯增加大鼠不自主的刻板運動，而應用7-NI預處理后，對刻板行為也無明顯改善。METH可導致nNOS蛋白表達水平增高、DA含量的降低及細胞凋亡增多等多種神經(jīng)毒性表現(xiàn)，nNOS特異抑制劑7-NI能部分減輕其神經(jīng)毒性作用。這些結果為下

21、一階段應用此動物模型進一步研究NOS下游通路的作用機制奠定了良好的基礎。
　　 2.L-NAME對METH導致的神經(jīng)毒性損傷作用具有保護作用，能減弱細胞形態(tài)學損傷、抑制凋亡、增加GSTP1表達水平，通過阻斷氧化應激的上游信號NOS活性發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用。中、高濃度L-NAME可用于METH神經(jīng)毒性損傷保護機制的研究。
　　 3.證明了攜帶GSTP1序列穿梭載體構建成功，在Ad-293細胞中觀察到綠色熒光的表達，證明病

22、毒在細胞進行包裝，轉染PC12細胞中發(fā)現(xiàn)綠色熒光，證明轉染成功。經(jīng)過qPCR以及western blotting的結果顯示腺病毒骨架質粒pAdEasy-1重組的轉染效率高。以上證明了GSTP1過表達載體的構建成功。為下一步研究GSTP1下游調控基因提供可靠的細胞模型。
　　 4.mRNA表達譜經(jīng)過GO分析，差異表達的基因主要參與的生物過程有核糖體合成、炎癥反應、抗凋亡的正向調節(jié)、過氧化氫代謝、線粒體電子傳遞泛醌-細胞色素C、氧化

23、應激反應、線粒體鈣離子轉運、多巴胺能突觸傳遞負向調節(jié)、過氧化氫反應、凋亡的正向調節(jié)、線粒體電子傳遞細胞色素C氧化、通過細胞色素C的caspase的活化、高熱反應等。Pathway分析顯示，METH組與正常對照組相比，差異基因主要參與了Alzheimer's disease、Parkinson's disease、糖酵解/糖異生、核糖體、氧化磷酸化、P53信號通路、凋亡、自然殺手細胞介導的細胞毒性、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、鈣信號通路等信號