杏仁核點燃大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬miRNA表達(dá)譜與神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見病，目前影響著全球0.5％～1％的人群。選擇性神經(jīng)元死亡和苔蘚纖維芽生等病理生理過程與癲癇的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小RNA，它通過誘導(dǎo)沉默復(fù)合體形成來降解靶mRNA，或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近越來越多的文獻(xiàn)報道，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極為重要的作用。本實驗通過建立杏仁核點燃癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的動物實驗來探討海馬mi

2、RNA表達(dá)譜的變化，并且對癲癇持續(xù)狀態(tài)后差異表達(dá)的miRNA與海馬神經(jīng)元凋亡的關(guān)系進(jìn)行了評估。
　　研究方法：
　　1、首先選用6～8周齡健康雄性SD大鼠，建立杏仁核點燃大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，于造模成功后24小時提取大鼠腦組織海馬區(qū)miRNA，采用高通量測序技術(shù)研究癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬區(qū)腦組織與正常大鼠海馬區(qū)腦組織中miRNA表達(dá)譜的差異。
　　2、隨后將篩選出的差異表達(dá)明顯的6個miRNA用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

3、應(yīng)(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)進(jìn)行驗證。
　　3、應(yīng)用靶基因預(yù)測軟件(RNAhybrid和miRand)對以上6個miRNA的目的候選靶mRNA進(jìn)行了預(yù)測，并使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行通路分析。
　　4、最后檢測此6個mi

4、RNA在癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時間點（4小時，24小時，1周和3周）的動態(tài)變化，與此同時應(yīng)用Nissel染色和TUNEL(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP end-labeling assay)染色檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)后不同時間點海馬神經(jīng)元生存和凋亡情況，進(jìn)一步評估篩選出的miRNA是否與癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元凋亡有關(guān)。
　　結(jié)果：
　　1、杏仁核點燃癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠

5、和對照組正常大鼠海馬組織差異表達(dá)的miRNA:在癲癇持續(xù)狀態(tài)后24小時檢測出差異表達(dá)的miRNA共37個，其中上調(diào)的miRNA有34個，下調(diào)的有3個。進(jìn)一步篩選出在癲癇持續(xù)狀態(tài)后變化大于2倍的(P＜0.01且P≠0)6個miRNA(miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p andmiR-99b-3p)，在以上6個篩選出的miRNA中，上調(diào)的miRNA表達(dá)差異最大

6、的是miR-879-5p(4.177倍)，差異最小的是miR-764-3p(2.078倍)，下調(diào)大于2倍的是miR-99b-3p。
　　2、采用qRT-PCR對結(jié)果進(jìn)行驗證:將篩選出的變化明顯的6個miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗證，miR-874-3p, miR-20a-5p，miR-345-3p，miR-365-5p，miR-764-3p的表達(dá)量與正常對照組相比明顯增高，而miR-99b-3p的表達(dá)量明顯下降，此與高通量測序結(jié)果

7、一致。
　　3、靶基因預(yù)測:利用RNAhybrid和miRand兩個靶基因預(yù)測軟件對篩選出的6個miRNA的靶mRNA進(jìn)行預(yù)測，KEGG通路分析進(jìn)一步顯示此6個miRNA的靶基因在癲癇持續(xù)狀態(tài)后凋亡通路中發(fā)揮十分重要的作用。
　　4、miRNA的動態(tài)變化和Nissel染色及TUNEL染色的病理結(jié)果:以上miRNA在癲癇持續(xù)狀態(tài)后1周表達(dá)量的變化最明顯，Nissel染色及TUNEL染色結(jié)果顯示在癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬區(qū)腦組織生存神