磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)的細(xì)胞傳輸與磁靶向轉(zhuǎn)運效果.pdf

1、基因轉(zhuǎn)運載體的選擇，是保障系統(tǒng)能夠高效、安全地攜帶基因作用于靶向部位、有效發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。層狀復(fù)合氫氧化物（Layered Double Hydroxides，LDHs），具有水滑石層狀晶體結(jié)構(gòu)，層片由兩種或兩種以上的金屬元素構(gòu)成，層板帶正電荷，層間存在可交換的陰離子。DNA可插入層間與LDH層板建立靜電、氫鍵作用以及發(fā)生空間位阻效應(yīng)，使LDHs/DNA雜化復(fù)合物具有特殊的細(xì)胞傳輸性能、良好的生物相容性、有利于降解以及控制釋放等優(yōu)勢

2、，因此LDH作為一種新型的基因轉(zhuǎn)運載體受到廣泛的關(guān)注和開發(fā)。
　　本文將DNA作為客體分子，以順磁性的鐵系離子構(gòu)成層板的磁性層狀復(fù)合氫氧化物（Magnetic Layered Double Hydroxides，MLDH）為載體，研究磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)（MLDH/DNA）的制備、細(xì)胞內(nèi)化及其體內(nèi)磁靶向轉(zhuǎn)運效果，為磁性層狀復(fù)合氫氧化物應(yīng)用于基因載體提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。本文的主要研究內(nèi)容包括以下三個部分：
　

3、　1.磁性層狀復(fù)合氫氧化物基因運載系統(tǒng)構(gòu)筑表征
　　用共沉淀法合成的MLDH作為載體，以表達綠色熒光蛋白的pEGFP-N1或鮭魚精DNA為客體，通過共沉淀和離子交換反應(yīng)方法，制備磁性MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物；利用粉末X射線衍射、紅外光譜分析及熱重分析方法進行了物相表征，通過凝膠阻滯實驗評價了不同條件下MLDH對DNA的結(jié)合與保護效果。XRD分析表明，MLDH具有六方晶系特征，DNA會干擾MLDH的層狀堆積秩序，但LDH層板結(jié)

4、構(gòu)在復(fù)合物中得到保留。Fe-O-Fe間距發(fā)生微小調(diào)整，MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物的（006）晶面衍射強度增大，并在14~17°區(qū)間出現(xiàn)新的晶相衍射。IR光譜證明，MLDH/DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)中MLDH與客體DNA共存、并發(fā)生了有效復(fù)合。MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物在67.7~650.0℃溫度區(qū)間，表現(xiàn)有三個失重段，分別與濕固相的含水量、LDH層板羥基的脫水縮合和層間有機殘基復(fù)合物的深度分解相關(guān)。透射電鏡觀察顯示，MLDH的層狀特征比普

5、通LDH強，但六邊形的不規(guī)則程度高，與DNA結(jié)合的親和力強，可形成大小不一、形狀不同的轉(zhuǎn)運復(fù)合物。凝膠阻滯實驗表明，MLDH能夠有效結(jié)合分子量小于1Kb的DNA。在不同pH條件下，尤其在酸性條件下，磁性層狀復(fù)合氫氧化物能夠有效保護層間DNA分子，低于生理條件的核苷酸酶和血清實驗證明，MLDH能夠保護DNA。MTT細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示MLDH對A549、SGC-7901和SKOV3三種不同株系的細(xì)胞增殖活性有一定影響，并對細(xì)胞的增殖抑制作

6、用存在一定的劑量、時間依賴性特征，細(xì)胞活性隨著MLDH濃度的增加而降低。
　　2.磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)的細(xì)胞傳輸過程研究
　　為了解MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化過程，MLDH/DNA復(fù)合物干預(yù)SGC-7901細(xì)胞，通過體外細(xì)胞吞噬鐵染色實驗方法，采用普通的倒置顯微鏡宏觀觀察了鐵染色陽性細(xì)胞；透射電鏡進一步跟蹤了MLDH/DNA復(fù)合物在亞細(xì)胞器中的分布特點；用YOYO-1核酸染料標(biāo)記MLDH/DNA復(fù)

7、合物，激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究了細(xì)胞的吞噬過程。結(jié)果表明：MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物能夠隨時間的推移，被細(xì)胞吞噬進入細(xì)胞質(zhì)，最終將DNA成功轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核。
　　3.磁性層狀復(fù)合氫氧化物-基因運載系統(tǒng)的體內(nèi)磁靶向轉(zhuǎn)運效果
　　用近紅外染料標(biāo)記基因運載系統(tǒng)、制成MLDH-DNA/Nucleic Acid Labeling復(fù)合物，以昆明小鼠為實驗動物，通過活體成像技術(shù)考察了MLDH/DNA基因轉(zhuǎn)運復(fù)合物在小鼠體內(nèi)的實時分布