牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及定植規(guī)律研究.pdf

1、本文研究了工廠化人工育苗條件下牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及定植規(guī)律，并分析了牙鲆仔稚幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)與餌料和水環(huán)境中菌群的關(guān)系，以及探討了腸道菌群形成機(jī)制，旨在為牙鲆人工育苗和養(yǎng)殖過程中腸道生理健康標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采用MiSeq16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，構(gòu)建牙鲆工廠化人工育苗模式下仔稚幼魚階段6個(gè)不同時(shí)期16S rRNA基因測(cè)

2、序文庫，共獲得7462個(gè)OTU，42個(gè)菌門，972個(gè)菌屬。初孵仔魚G1樣品中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度分別為55.20％、13.37%和21.58%；9日齡G2和21日齡G3腸道的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)較單一，變形菌門（＞90%）成為此時(shí)期腸道的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群；45日齡后，變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低，厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度明顯增大，成

3、為腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌群。屬水平上，仔稚幼魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量都發(fā)生了較大變化，在9日齡和21日齡時(shí)期變形菌門中的弧菌屬（Vibrio）相對(duì)豐度最高，到45日齡時(shí)期后其相對(duì)豐度銳減到最低水平；在80日齡時(shí)期，擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）相對(duì)豐度達(dá)到較高水平，成為腸道優(yōu)勢(shì)菌屬；在115日齡時(shí)期，厚壁菌門中有8個(gè)菌屬均發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　2.通過16S rRNA高通量測(cè)序分析，

4、探明了牙鲆工廠化人工育苗餌料系列中各種餌料樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)特征及其與仔稚幼魚菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)系。輪蟲餌料F2中變形菌門（78.21%）和擬桿菌門（13.33%）最多，而厚壁菌門(2.28%)和藍(lán)藻菌門（Cyanobacterium）(1.47%)的相對(duì)豐度很低；共有14個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬。鹵蟲餌料 F3中的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，三者 OTU相對(duì)豐度之和大于98.26%；11個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬中弧菌屬（28.34%）和假交替單胞菌屬（12.

5、36%）的相對(duì)豐度最高；輪蟲和鹵蟲兩種活生物餌料的優(yōu)勢(shì)菌屬差異明顯，僅假交替單胞菌屬和紅桿菌屬（Rhodobacter）為共有優(yōu)勢(shì)菌屬。配合飼料F4中的優(yōu)勢(shì)菌屬分布較為均勻，共有12個(gè)，大多屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱，其中乳球菌屬（Lactococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棲熱菌屬（Thermus）三者相對(duì)豐度最高，均大于6%。配合飼料 F5中的優(yōu)勢(shì)菌屬為腐敗希瓦菌屬（Shewanella）、嗜冷桿菌屬（Psyc

6、hrobacter）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），與F4相比差別較大；配合飼料F6中藍(lán)藻菌門的豐度達(dá)到最高為74%，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　水體樣品的菌群結(jié)構(gòu)在門分類水平上變化不大，優(yōu)勢(shì)菌群都是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，但是各時(shí)期樣品優(yōu)勢(shì)菌屬變化明顯。1日齡W1樣品中菌群多樣性豐富，有14個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬；9日齡W2樣品中，變形菌門是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，擬桿菌門中的黃桿菌目（Flavobacteriales）的相對(duì)豐度增加到

7、32.4%，厚壁菌門中的乳球桿菌的豐度增加到1.96%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬；21日齡W3樣品中擬桿菌門中的優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度降低，而γ-變形菌門的總豐度高達(dá)73.45%，其中，弧菌屬和假交替單胞菌屬的相對(duì)豐度最高，分別為20.7%和13.7%；45日齡W4樣品中黃桿菌目的相對(duì)豐度約為17.34%，但優(yōu)勢(shì)菌的種類減少到2個(gè)；80日齡水體W5中優(yōu)勢(shì)菌屬的種類減少，而優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度增加，其中γ-變形菌中的假交替單胞菌屬的相對(duì)豐度達(dá)到38.94%；11

8、5日齡 W6中除了乳球菌屬的相對(duì)豐度增加成為優(yōu)勢(shì)菌屬，菌群結(jié)構(gòu)變化不大，與W5時(shí)期組成相似。
　　3.對(duì)6個(gè)取樣階段餌料、水與腸道樣品菌群的相似關(guān)系分析。牙鲆在攝食活餌料輪蟲和鹵蟲階段，腸道菌群與餌料的相似性較高，分別為17.61%、41.11%；在轉(zhuǎn)換配合飼料后，腸道菌群與配合飼料的菌群相似性逐漸降低，115日齡時(shí)，與餌料的相似性僅為3.34%，而且共有優(yōu)勢(shì)菌屬消失。初孵仔魚樣品與水體菌群的相似性最高為26.77%，共有優(yōu)勢(shì)菌屬

9、3個(gè)；在開口后9日齡至80日齡的4個(gè)時(shí)期，腸道菌群與水體菌群的相似性均在7%左右；115日齡時(shí)腸道菌群與水體菌群的相似性降到1.15%，而且兩者沒有共同的優(yōu)勢(shì)菌屬存在。對(duì)腸道與餌料樣品、腸道與水體樣品進(jìn)行 RELATE分析，結(jié)果顯示腸道菌群與餌料之間的相關(guān)性（ Spearman correlation Rho0.588，P＜0.05）遠(yuǎn)高于腸道菌群與水體之間的相關(guān)性（Spearman correlation Rho0.15，P＜0.5）

10、；說明在牙鲆仔稚幼魚腸道菌群的形成過程中，餌料中的微生物對(duì)腸道菌群的影響大于水中微生物的影響，其對(duì)腸道菌群的影響起主要作用。
　　4.牙鲆仔稚幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。牙鲆開口后，腸道菌群發(fā)生明顯的演替，仔稚幼魚腸道優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量都發(fā)生了較大變化。攝食活餌料階段變形菌門主要定植在腸道內(nèi)，弧菌屬相對(duì)豐度最高；45日齡時(shí)期后變形菌門相對(duì)豐度逐漸減低，擬桿菌門和厚壁菌門豐度增加；在80日齡至115日齡時(shí)期，擬桿菌門的擬桿菌屬、普氏