牙鲆（Paralichthys olivaceus）外周血單個核細胞的離體培養(yǎng)和細胞學研究.pdf

1、牙鲆(Paralichthys olivaceus)肉質鮮美、營養(yǎng)豐富，是我國北方沿海地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟海產(chǎn)魚類之一。但隨著近年來養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，牙鲆腹水病、病毒性神經(jīng)壞死癥等各種病害的爆發(fā)和流行給生產(chǎn)企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于對牙鲆免疫機理和機制的了解較少，尚無有效的免疫防治技術和方法，仍然采用化學藥物和抗生素等傳統(tǒng)的方式來控制病害的發(fā)生。但長期使用抗生素使病菌的抗藥性越來越強，并且大量的藥物殘留嚴

2、重破壞了生態(tài)環(huán)境,食用魚的安全性也受到了影響。外周血單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，是魚類體液免疫的重要組成部分，在魚類特異性免疫和非特異性免疫過程中起著重要作用。目前對于牙鲆單個核細胞的免疫功能研究尚屬起步階段，尚不清楚其作用機制。本研究以養(yǎng)殖牙鲆為材料，對外周血單個核細胞進行離體培養(yǎng)和細胞學觀察，同時對單個核細胞的吞噬功能和細胞膜表達離子通道的電生理特征進行了觀察。為建立牙鲆血細胞離體培養(yǎng)技術和探究細胞免疫功能奠定基礎。

3、通過對牙鲆外周血細胞的分離鑒定，確定單個核細胞的形態(tài)特征,用密度梯度離心的方法，分離出純凈的單個核細胞層細胞，分析不同因素對細胞離體存活和生長的影響，優(yōu)化營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，建立離體細胞培養(yǎng)方法。并對離體培養(yǎng)的淋巴細胞和單核細胞進行細菌吞噬實驗和膜表達離子通道研究，主要研究結果和結論如下： 1.通過對牙鲆外周血進行染色，可在光鏡下鑒別出紅細胞、血栓細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、和嗜堿性粒細胞7種細胞。利用

4、細胞分層液(比重為1.083)，20℃，水平離心3000r／min，15min，Hank's溶液洗滌，可得純凈的單個核細胞。 2.離體培養(yǎng)的單個核細胞在含20％胎牛血清、終濃度100U／ml青霉素和鏈霉素、終濃度為O．5mmol／L谷氨酰胺、添加PHA(30μg／ml)的M199培養(yǎng)液中，于25℃，24孔培養(yǎng)皿(Costar，美國)中能夠貼壁生長傳至6代，存活30天以上。貼壁生長的單核細胞形狀不規(guī)則，長徑11.05±0.91μm

5、，短徑9.55±1.39 μm；淋巴細胞近似呈圓形，長徑7.31±1.05μ m，短徑6.13±0.97μm。均呈鵝卵石狀緊密排列，并有接觸性抑制現(xiàn)象，長滿單層時細胞會脫壁懸浮。 3.將離體培養(yǎng)傳至第二代(7d)的單個核細胞用于金黃色葡萄球菌吞噬實驗。單核細胞在發(fā)生吞噬時，細胞常通過變形運動把細菌包裹至細胞內，吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)分別為(61.9±3.05)％和1.58±0.51。淋巴細胞常見到細菌粘到細胞表面，吞