肝細胞癌早期發(fā)現(xiàn)多重定量抗體芯片的構(gòu)建及臨床驗證.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種進展快、預后差、侵襲性及轉(zhuǎn)移性強的惡性腫瘤。在全球癌癥病死率中已上升至第3位，在國內(nèi)居第2位。由此可見，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療在肝癌研究中的重要性和迫切性。AFP是目前全世界應用最廣泛的肝癌血清學標志物，但臨床上約40％的肝癌患者血清AFP檢測為陰性，在妊娠婦女、急慢性肝炎、生殖腺腫瘤和胃腸道腫瘤等人群中也可能升高;而影像學檢查往往不能成為普查方式，且常在腫

2、瘤長到0.5～1cm以上時才可見，早期發(fā)現(xiàn)概率不高。因此肝癌的早期診斷僅靠AFP易造成誤診和漏診。為了彌補單一指標檢測的不足，提高肝癌早期診斷的準確性，多個腫瘤標志物的聯(lián)合檢測已成必然趨勢。
　　蛋白質(zhì)組學技術(shù)的發(fā)展使得篩選新的腫瘤血清蛋白標志物成為可能。借助該技術(shù)，研究者們不僅發(fā)現(xiàn)了許多與肝癌早期發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系的差異表達蛋白（潛在的腫瘤標志物）。還開辟了改善癌癥相關(guān)血清標志物發(fā)現(xiàn)與鑒定的新途徑—高靈敏度、高特異性、微型化，

3、集成化，高通量化的抗體芯片技術(shù)。作為一種在基片表面固定多種高親和性和高特異性抗體并可用于平行檢測樣本中蛋白表達水平的通量化蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)，它解決了傳統(tǒng)的蛋白檢測分析技術(shù)一次實驗只能分析一種靶蛋白分子，在分析通量上難以滿足對眾多的潛在腫瘤血清蛋白標志物篩選分析的需求問題，并且已經(jīng)向臨床應用上發(fā)展，比如腫瘤標志物抗體芯片等。因此，抗體芯片技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)與肝癌早期發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血清蛋白標志物，這將極大地推進肝癌相關(guān)血清蛋白標志物的研究

4、進展，為肝癌的早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。
　　研究技術(shù)路線:┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓┃用ELISA方法篩選有潛在臨床應用價值的TM┃┃┣━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┫┃↓┃┃用于肝癌早期發(fā)現(xiàn)定量抗體芯片的構(gòu)建┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃┃→優(yōu)化抗體芯片制備及檢測的工作條件┃┃┃→考察構(gòu)建定量抗體芯片方法的重復性及穩(wěn)定性┃┃┃→

5、ELISA萬法與定量抗體芯片方法的相關(guān)性分析┃┃┃→ELISA與定量抗體芯片的方法學比較┃┃┃┃┣━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫┃創(chuàng)建用于肝癌早期發(fā)現(xiàn)的判別模型┃┃↓┃┣━━━┳━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┫┃┃多重定量抗體芯片的臨床驗證┃┃┗━━━┻━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛
　　第一部分 HCC早期發(fā)現(xiàn)腫瘤血清蛋白標志物的選擇
　　肝癌早期診斷

6、標志物的研究一直是肝臟疾病蛋白質(zhì)組學研究的一個熱點。人類肝癌發(fā)生的背景，絕大多數(shù)與肝炎病毒(HBV、HCV)的慢性持續(xù)性感染有關(guān)，有著乙肝病毒感染→慢性肝炎→肝硬化→肝癌的發(fā)生發(fā)展模式。
　　近年來，隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術(shù)的發(fā)展和應用，肝癌血清標志物的研究取得了新的進展，許多與早期診斷存在密切聯(lián)系的潛在血清蛋白標志物被發(fā)現(xiàn)。據(jù)報道，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，慢性炎癥的刺激導致腫瘤釋放許多直接促進其自身生長的因子，從而

7、構(gòu)成了炎性微環(huán)境，主要由腫瘤細胞、宿主細胞、細胞外基質(zhì)、分泌因子等組成，各成分之間的交互作用形成一個龐大而復雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。因此，慢性病毒感染機體后，效應T細胞及Th細胞釋放的多種細胞因子（IL-6、IL-10、TNF等），在體內(nèi)構(gòu)成免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，作用于病毒感染的靶細胞，這些因子與相應受體結(jié)合，引起組織或器官的免疫病理損傷[1]，故檢測肝癌患者體內(nèi)血清細胞因子的含量能夠在一定程度上反映病情的發(fā)生發(fā)展及預

8、后。研究還發(fā)現(xiàn)，癌細胞及其間質(zhì)細胞可分泌多種化學趨化因子及生長因子（IL-8、 HGF、TGF-β1、VEGF等）從而促進腫瘤血管生成及腫瘤浸潤能力[2]，與HCC的發(fā)生發(fā)展、生物學行為及預后密切相關(guān)，已成為HCC預測的重要生物學標志物[3]。但研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血清蛋白標志物均為非特異的腫瘤相關(guān)抗原，其單獨檢測腫瘤的敏感性及特異性有限。因此在積極研究探索新的肝癌早診血清標志物的同時，對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的潛在的肝癌早診標志物進行全面、系統(tǒng)的血清學篩選

9、和優(yōu)化組合，從中挖掘出更多的具有臨床診斷價值的血清標志物以早期發(fā)現(xiàn)和輔助診斷肝癌一直是蛋白質(zhì)組學的努力方向。
　　為此我們運用傳統(tǒng)的免疫分析方法—酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immune sorbentassay，ELISA)，對研究報道較多的、具有腫瘤早診潛能的血清標志物進行檢測，范圍包括肝癌的蛋白質(zhì)抗原、酶和同工酶、細胞因子等多方面。我們對50例肝癌患者和32例肝硬化患者血清，進行了15種蛋白質(zhì)(HGF、IG

10、F、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF、HCCR、SCCA、GPC3、GP73、DCP、AFP-L3、AFU、HSP27)濃度的定量檢測，根據(jù)檢測結(jié)果中15種蛋白質(zhì)分別在HCC和LC患者血清中的濃度、上調(diào)及下調(diào)的趨勢、P值，并以炎癥性細胞因子與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)為依據(jù)，以構(gòu)建多重定量抗體芯片中抗體間高度特異性的相關(guān)選擇為目標，篩選和最終確定了AFP聯(lián)合7種腫瘤血清蛋白標志物（主要以細胞因子），包括AFP、HGF、IGF、

11、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β1和VEGF作為構(gòu)建多重腫瘤血清蛋白標志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測系統(tǒng)的組成。
　　第二部分多重腫瘤血清蛋白標志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測系統(tǒng)的構(gòu)建
　　鑒于傳統(tǒng)的腫瘤標志物的臨床檢測技術(shù)—ELISA、免疫組織化學(IHC)、放射免疫分析(RIA)等，只能檢測單個或有限指標的局限性，以微列陣技術(shù)對生物樣品作整體蛋白質(zhì)表達分析的蛋白質(zhì)芯片在后基因組時代越來越受到重視?？贵w芯片(antibody

12、 microarray)是蛋白質(zhì)芯片的一種，具有高通量、快速、平行分析生物樣品、高信噪比和所需樣本量少等優(yōu)點，是檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為平行性的定性和定量檢測生物樣品中蛋白質(zhì)分子的重要平臺，并能夠較全面和準確地反映出在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的蛋白質(zhì)表達水平的變化，尤其在對腫瘤的相關(guān)蛋白的分析研究中，通過篩選及鑒定具有臨床應用價值的腫瘤標志物，進行腫瘤的早期診斷及治療監(jiān)測。目前臨床常采用多腫瘤標志物(tumor

13、markers，TM)聯(lián)合檢測，應用多變量分析方法，以利于肝癌篩查及早期診斷的準確性。為此，在第一部分工作的基礎(chǔ)上，我們購置了與肝癌早期診斷相關(guān)的8種腫瘤血清蛋白標志物(AFP、HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL-10、TGF、VEGF)的標準品、單克隆抗體及抗體芯片等材料，運用雙抗體夾心法確定了抗體間的最佳濃度，排除了各抗原、抗體之間交叉反應，實現(xiàn)了抗體的有效固定及理想的檢測信號，獲得了每個腫瘤標志物的檢測范圍、最低檢測限、精密

14、度及芯片的穩(wěn)定性，實現(xiàn)了實驗條件的優(yōu)化研究，成功構(gòu)建了可用于臨床血清樣品篩查的多重抗體芯片定量檢測系統(tǒng)，并與傳統(tǒng)的ELISA法在檢測能力與相關(guān)性上進行了比較。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，對于相同樣品二種方法有很好的相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，我們初步進行了臨床驗證。
　　第三部分多重腫瘤血清蛋白標志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測系統(tǒng)的臨床驗證
　　利用構(gòu)建的抗體芯片檢測系統(tǒng)檢測了218例血清樣本，其中肝硬化患者58例，平均年齡46.7歲（2

15、3-68歲），男性46人，女性12人;肝癌患者160例，平均年齡46.5歲（22-71歲），男性128人，女性32人，均經(jīng)臨床確診。通過定量檢測8種常見腫瘤血清蛋白標志物（AFP聯(lián)合7種細胞因子）分別在HCC及LC患者血清中的濃度，并對臨床資料進行回顧性研究，應用SPSS軟件做Logistic回歸分析，利用訓練集創(chuàng)建診斷模型，獲得AFP聯(lián)合7種細胞因子各單項指標及其聯(lián)合的受試者工作曲線(receiver operating charac

16、teristic curve，ROC)、曲線下面積(area under the curve，AUC)以及Cut off值，并在測試集中驗證了模型的診斷價值。結(jié)果顯示8種腫瘤標志物Logistic回歸模型的AUC為0.940（cut off值0.31），而AFP其AUC為0.665（cut off值20ng/ml），二者差異顯著，p＜0.001。AFP聯(lián)合7種細胞因子在訓練集中診斷的敏感性為93.3％，特異性為83.3％，準確性為90.

17、9％;在測試集中敏感性為89％，特異性為77.3％，準確性為86％，明顯優(yōu)于血清AFP的診斷能力，后者診斷的敏感性為70％，特異性為59％，準確性為64％。多重定量抗體芯片檢測系統(tǒng)具有較高敏感性和特異性，AFP聯(lián)合7種細胞因子診斷模型對肝癌早期診斷優(yōu)于傳統(tǒng)AFP，具有潛在的臨床應用價值。驗證流程:
　　結(jié)論
　　1.利用50例肝癌患者和32例肝硬化患者的血清，應用ELISA方法獲取了15種具有潛在臨床應用價值的腫瘤血清蛋白標

18、志物的定量數(shù)據(jù)，篩選和最終確定了AFP聯(lián)合7種細胞因子(HGF、IGF、IL-6、IL-8、I-10、TGF、VEGF)為多重腫瘤血清蛋白標志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測系統(tǒng)的組成。
　　2.確立了雙抗體夾心法對8種腫瘤標志物的檢測范圍、最低檢測限、精密度、穩(wěn)定性、ELISA法相關(guān)性及二者在檢測能力上的的比較，成功構(gòu)建了可用于臨床血清樣品篩查的多重腫瘤血清蛋白標志物聯(lián)合定量抗體芯片檢測系統(tǒng)。
　　3.應用多重定量抗體芯片檢測系統(tǒng)結(jié)

19、合臨床樣本，運用Logistic回歸分析創(chuàng)立了AFP聯(lián)合7種細胞因子的肝癌早期發(fā)現(xiàn)診斷模型，并驗證了該模型潛在的臨床應用價值。
　　潛在應用價值
　　1.可通量化檢測血清中多種腫瘤蛋白標志物的抗體芯片的構(gòu)建，有助于肝癌血清標志物的基礎(chǔ)研究能盡快應用于HCC的臨床早期診斷中。
　　2.AFP聯(lián)合7種細胞因子作為肝癌早期發(fā)現(xiàn)的血清蛋白標志物，可提高肝癌早期診斷的敏感性、特異性和準確性。
　　創(chuàng)新點
　　1.運用