藤茶中黃酮、二氫楊梅素的提取分離、降血脂作用及藤茶安全評(píng)價(jià)的研究.pdf

1、藤茶為我國(guó)特有茶用、藥用植物,富含二氫楊梅素等黃酮類(lèi)物質(zhì)。有關(guān)藤茶的研究主要集中在藤茶活性成分的分離鑒定及黃酮抗菌、抗氧化、降血糖作用等方面。本文在對(duì)藤茶飲用的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上,以活性為跟蹤,采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)法研究了藤茶主要活性成分黃酮及二氫楊梅素的提取條件,比較了不同藤茶原料黃酮含量及其活性的變化,篩選了利用大孔樹(shù)脂純化藤茶黃酮的分離條件,對(duì)藤茶水提物、黃酮及二氫楊梅素的降血脂作用及其機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期為藤茶的開(kāi)發(fā)應(yīng)

2、用提供理論基礎(chǔ)。
　　 1、藤茶黃酮提取條件的研究
　　 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法研究了溫度、時(shí)間、料液比、乙醇濃度對(duì)藤茶黃酮和二氫楊梅素(DHM)提取率、黃酮純度及其對(duì)O2.-自由基清除率的影響。結(jié)果表明,溫度、時(shí)間、料液比極顯著影響藤茶黃酮及二氫楊梅素的提取率,建立的回歸模型顯著性檢驗(yàn)達(dá)極顯著水平,回歸模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M和。結(jié)合黃酮的純度和對(duì)O2.-自由基清除率活性分析,藤茶

3、黃酮的最佳浸提條件:乙醇濃度在-0.8～1水平(67％～85％),浸提溫度在0～1水平(65℃～77.5℃),浸提時(shí)間在-1～0.3水平(60min～100min),料液比在0～1水平(1:30～40)。根據(jù)二氫楊梅素的提取率和含量分析,其最佳提取條件為:提取溫度在-0.8～0.03水平(55℃～65℃),時(shí)間在-0.1～0.1水平(86min～93min),料液比在0～0.5水平(1:30～35),乙醇濃度在0.5～0.1水平(74％

4、～80％)。
　　 2、不同藤茶原料黃酮含量及活性的研究
　　 2.1生育期的影響。對(duì)藤茶不同嫩度以及新梢不同部位原料的黃酮、二氫楊梅素含量及黃酮清除O2.-自由基的活性進(jìn)行分析,表明隨著原料的老化,黃酮含量及其清除O2.-自由基的能力呈下降趨勢(shì)。二氫楊梅素的變化趨勢(shì)與黃酮基本相同。與葉片相比,藤茶梗中黃酮和二氫楊梅素的含量最低,但活性卻相對(duì)較高。提示一方面藤茶中的活性黃酮主要集中在葉片,尤其是生育旺盛的部位積累最多,另

5、一方面莖梗與葉片黃酮的組成可能存在較大差異。
　　 2.2栽培條件的影響。分別對(duì)栽培型、野生型、仿野生型藤茶的黃酮和二氫楊梅素含量以及清除O2.-自由基的活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明,黃酮和二氫楊梅素含量以及清除O2.-自由基的活性大小依次為野生型>仿野生型)栽培型。提示藤茶生長(zhǎng)條件的改變已對(duì)體內(nèi)生理生化變化產(chǎn)生了較大影響。
　　 2.3產(chǎn)地的影響。分析了全國(guó)主要藤茶產(chǎn)地湖南、湖北、廣東、廣西、江西、福建等地所產(chǎn)藤茶原料中黃酮

6、、二氫楊梅素含量及其活性變化。結(jié)果表明,以廣東連南、福建武平、江西定南所產(chǎn)藤茶的黃酮及二氫楊梅素含量最高,湖南桑植、茶陵、恩施來(lái)風(fēng)所產(chǎn)藤茶的黃酮及二氫楊梅素含量相對(duì)較低。各地藤茶黃酮清除O2.-自由基的能力與其含量的相關(guān)性不明顯(r=0.2769),但與二氫楊梅素的含量呈極顯著的正相關(guān)(r=0.8330)。由此說(shuō)明,藤茶黃酮的活性主要與其組成有關(guān),而二氫楊梅素是黃酮活性的主體成分。
　　 2.4葉型的影響。對(duì)大、中、小三種不同葉

7、型的藤茶黃酮進(jìn)行分析,表明黃酮和二氫楊梅素含量高低依次為中葉>小葉>大葉,黃酮清除O2.-自由基的活性大小依次為小葉>中葉>大葉,但小葉和中葉型藤茶黃酮的活性變化差異不顯著。說(shuō)明在進(jìn)行品種選育時(shí)應(yīng)以中、小葉型藤茶為主。
　　 3、藤茶中黃酮的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　 選用11種大孔樹(shù)脂對(duì)藤茶黃酮進(jìn)行了靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,1號(hào)樹(shù)脂適宜于藤茶黃酮的分離純化,對(duì)黃酮的吸附量可達(dá)41.41mg/g,解析率達(dá)到89.5

8、％。通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)1號(hào)樹(shù)脂有關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,黃酮上樣濃度6-7mg/ml,上樣體積為柱體積的1/3,流速1.8ml/min,用95％的乙醇進(jìn)行洗脫,可達(dá)到較好的洗脫與純化效果,黃酮的洗脫率可達(dá)90％左右,洗脫出的黃酮純度達(dá)65％左右。進(jìn)一步利用重結(jié)晶方法得到純度為98.7％的純品,經(jīng)紫外可見(jiàn)光譜,紅外光譜、LC-Ms分析表明,黃酮中的主要成分為二氫楊梅素。
　　 4、藤茶安全性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
　　 根據(jù)保

9、健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范對(duì)藤茶安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,受試藤茶屬無(wú)毒級(jí)；3項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果均為陰性。大鼠90天喂養(yǎng)試驗(yàn)中,藤茶各劑量組動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育良好,對(duì)體重、食物利用率無(wú)不良影響。各劑量組血常規(guī)、白細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果與對(duì)照組無(wú)顯著差異。大鼠血清ALT、AST、BUN、TC、TG、CRE、GLU、ALB、TP測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。臟器系數(shù)與對(duì)照差異不明顯。肝、心、脾、腎、胃腸、睪丸、卵巢等器官外觀和組織切片與對(duì)照相比

10、均未發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病理改變。說(shuō)明飲用藤茶安全無(wú)毒。
　　 5、藤茶提取物降大鼠及人體血脂作用研究
　　 用大鼠脂質(zhì)代謝紊亂模型法研究藤茶提取液對(duì)大鼠的降血脂作用。結(jié)果表明,與高脂模型組比較,藤茶高劑量組(4.5g/Kg.bw)大鼠血清TC顯著降低,高、中劑量組(3.0g/Kg.bw)血清TC下降>10％；高、中劑量組TG顯著降低,其中,高劑量組TG下降>15％；高、中、低劑量組(1.5g/Kg.bw)HDL-C顯著升高,其中

11、,高劑量組HDL-C升高值>0.12mmol/L。人體臨床試驗(yàn)表明,服用藤茶組降TC有效率為42.0％,降TG有效率為72.0％,降血脂有效率為28.0％,極顯著高于對(duì)照組。服用藤茶組血清TC、TG明顯降低,與試用前及對(duì)照組比較差異極顯著。試驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后血液學(xué)指標(biāo)及血生化指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著變化。提示藤茶提取物對(duì)大鼠及人體都有輔助降血脂的作用。
　　 6、藤茶中黃酮及二氫楊梅素降血脂作用研究
　　 對(duì)藤茶中主要活性成分黃酮

12、及二氫楊梅素對(duì)高血脂癥小鼠的降血脂效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,與高脂模型組比較,0.5g/kg.bw灌胃(ig)劑量的二氫楊梅素能明顯減輕小鼠體重；各劑量黃酮都能顯著降低小鼠血清TG含量；0.3g/kg.bw ig劑量二氫楊梅素能顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量,0.5g/kg.bw ig劑量二氫楊梅素能極顯著提高血清HDL-C含量；黃酮及二氫楊梅素都能明顯提高小鼠血清SOD活性,降低血清MDA含量及肝系數(shù)。肝臟病理學(xué)觀察表明,

13、藤茶黃酮及二氫楊梅素能降低肝細(xì)胞變性、腫脹的程度。說(shuō)明藤茶黃酮及二氫楊梅素能降低小鼠血脂,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,減輕高脂對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。
　　 7、二氫楊梅素發(fā)揮生理活性的機(jī)理研究
　　 結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)原理,應(yīng)用紫外吸收光譜、熒光光譜等方法對(duì)二氫楊梅素與牛血清白蛋白(BSA)相互作用機(jī)理進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,在弱堿性條件下,二氫楊梅素易解離成為陰離子,紫外吸收峰發(fā)生明顯紅移；在生理pH(7.4)下,BSA中加入不同濃度

14、的二氫楊梅素后,吸收峰發(fā)生了紅移。二氫楊梅素對(duì)BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有較強(qiáng)的猝滅作用,屬靜態(tài)猝滅類(lèi)型,猝滅速率常數(shù)Kq=3.97×1012；二氫楊梅素與BSA之間結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.97,結(jié)合常數(shù)KA=5.04×109。Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+金屬離子的存在會(huì)使二氫楊梅素與BSA的速率猝滅常數(shù)增大,結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)降低,減小了二氫楊梅素與BSA的結(jié)合,而Fe3+使二氫楊梅素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)都增加,提高了二氫楊