肩袖岡上肌骨-肌腱結(jié)合部損傷愈合模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　 骨-肌腱結(jié)合部(Bone-Tendon Junction, BTJ)損傷是一種常見的疾病。目前對于肩袖損傷后的BTJ損傷修復(fù)機(jī)制尚未闡明，尤其在肌腱與骨愈合期間，任何過于激進(jìn)的康復(fù)都有可能導(dǎo)致結(jié)合部斷裂而失敗。因此，我們需要構(gòu)建一種合適的動(dòng)物模型，進(jìn)一步探索能有效改進(jìn)肩袖BTJ愈合的速度和強(qiáng)度的新方法。本研究根據(jù)肩袖損傷的臨床特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了SD大鼠的岡上肌腱損傷愈合的模型，并驗(yàn)證該模型的實(shí)用性。
　　 目的：

2、
　　 本研究設(shè)計(jì)了新的肩袖岡上肌BTJ損傷愈合動(dòng)物模型，以模擬BTJ損傷后愈合的組織學(xué)過程，為肩袖岡上肌損傷愈合機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
　　 雌性SD大鼠40只（第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重(180-200)g。5只大鼠為正常對照組，其余35只為實(shí)驗(yàn)組，分別在建模后7d、14d、21d各處死10只進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化觀察，實(shí)驗(yàn)組行左肩關(guān)節(jié)岡上肌損傷與重建手

3、術(shù)，對照組不處理。
　　 2、模型制備的手術(shù)方法:
　　 10％水合氯醛注射液400mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后取俯臥位并置于無菌臺。在左肩部肩胛岡區(qū)域，肩胛骨下緣切開2-3cm橫行皮膚切口，沿大圓肌與背闊肌肌間隙斜向上銳性剝離至肩胛骨，顯露肩胛骨中下段，輕微可見肩胛骨下緣外側(cè)岡上肌以及腱性部分，沿腱性部分找到與左側(cè)肱骨連接部，并顯露肱骨頭，將SD大鼠一側(cè)肩的岡上肌腱自骨-肌腱結(jié)合部切斷，用布巾鉗在大結(jié)節(jié)原岡上肌附著的

4、足跡處建立兩個(gè)平行的骨性隧道，再用不可吸收肌腱縫合線穿過骨道，將岡上肌腱縫合在原位，建立SD大鼠骨表面BTJ損傷愈合模型。
　　 3、取材及制作標(biāo)本:
　　 分別在建模后7d、14d、21d各處死10只進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化觀察，切取岡上肌腱遠(yuǎn)端以及與其相連的肱骨骨塊為一個(gè)完整的BTJ樣本，同時(shí)取1只正常組大鼠的左側(cè)BTJ樣本為對照。進(jìn)行HE染色，比較愈合過程不同時(shí)間BTJ中瘢痕組織的形成和轉(zhuǎn)歸的特點(diǎn)，以及纖維軟骨的分布及

5、其與正常BTJ的差別。免疫組化染色，400倍光鏡下觀察切片中TGF-β1、AR-Smads的表達(dá)和分布情況。
　　 4、觀察方法和結(jié)果測定:
　　 400倍光鏡下觀察切片中TGF-β1、AR-Smads的表達(dá)和分布情況，每張切片選隨機(jī)取5個(gè)高倍視野。采用二級計(jì)分法判定結(jié)果:按染色強(qiáng)度分級，淡黃為1分，黃或深黃2分，褐或棕黃色3分;陽性細(xì)胞計(jì)＜10％為0分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)10％～25％為1分。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)25～50％為2分，

6、陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)50～75％為3分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)＞75％為4分;兩者相加＜2分為陰性（-）;2～3分陽性(+);4～5分中等陽性(++);6～7分強(qiáng)陽性(+++)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 不同時(shí)間點(diǎn)的TGF-β1、AR-Smads的陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)，以明確TGF-β1、AR-Smads的表達(dá)在不同時(shí)間點(diǎn)是否存在差異。
　　 結(jié)果
　　 1、觀察岡上肌腱遠(yuǎn)端以及與其相連的肱骨骨塊完整的BTJ樣本比

7、較。對照組:可見正常岡上肌肌腱與肱骨的正常骨腱連接;術(shù)后7d、14d、21d組:可見岡上肌肌腱與肱骨連接處周圍瘢痕組織明顯增生，且隨時(shí)間增加瘢痕組織增生范圍逐漸增大。
　　 2、HE染色光學(xué)顯微鏡觀察:HE染色示BTJ處肌腱纖維、軟骨以及骨組織層次清楚，細(xì)胞排列整齊。術(shù)后7d、14d: HE染色示BTJ處梭形成纖維細(xì)胞滿視野，未見軟骨細(xì)胞。術(shù)后21d: HE染色示BTJ處成纖維細(xì)胞內(nèi)可見散在少量軟骨細(xì)胞增生。
　　 3、

8、免疫組化普通光學(xué)顯微鏡觀察。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 TGF-β1在術(shù)后7d時(shí)陽性率20％，14d時(shí)陽性率60％，21d時(shí)陽性率50％，其中14d與7d相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 AR-Smads在術(shù)后7d時(shí)陽性率分別為30％，14d時(shí)率70％，21d時(shí)陽性率60％，其中在14d與7d相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，21d與14d相比

9、無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論
　　 研究表明，在肌腱修復(fù)后腱骨界面愈合早期有多種生長因子高表達(dá)，但其中被認(rèn)為與瘢痕的形成關(guān)系最為密切的是TGF-β1。在大鼠前交叉韌帶重建的模型中，術(shù)后4天BTJ內(nèi)便可見分泌TGF-β1的主要細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的積聚，一直持續(xù)到術(shù)后3-4周。在大鼠岡上肌止點(diǎn)損傷修復(fù)的愈合早期，TGF-β1在止點(diǎn)處積聚，在術(shù)后10天達(dá)到高峰，正好與隨后的BTJ瘢痕增生的高峰吻合。本研究發(fā)現(xiàn)，T