發(fā)夾狀核酶基因治療乙型肝炎病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究針對(duì)HBV C區(qū)的G<,11>位飽和突變的發(fā)夾狀核酶的體外制備與活性比較.方法:用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)針對(duì)HBV C區(qū)的發(fā)夾狀核酶基因,并把合成的G<,11>位飽和突變的發(fā)夾狀核酶基因片段克隆入自剪核酶載體p1.5的3'-cis-Rz或5'-cis-Rz之間.四種發(fā)夾狀核酶通過(guò)重組質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄獲得.用<'32>P標(biāo)記含有HBV C區(qū)的pKC的體外轉(zhuǎn)錄物作為靶RNA,變性PAGE純化.把未標(biāo)記的各種核酶與同位素標(biāo)記的靶RNA在不同條件下

2、進(jìn)行切割反應(yīng),進(jìn)行PAGE放射自顯影后分析反應(yīng)結(jié)果.構(gòu)建發(fā)夾狀核酶和HBV的真核表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株,通過(guò)Southern Blot分析核酶胞內(nèi)抑制HBV復(fù)制的作用.結(jié)論:該試驗(yàn)制備的發(fā)夾狀核酶HpRz<,C>具有特異的催化切割活性;它有望在不遠(yuǎn)的未來(lái)可發(fā)展成為治療乙型肝炎的核酸藥物.從G<,11>位突變的發(fā)夾狀核酶的切割活性的比較中證實(shí),G<,11>位點(diǎn)對(duì)于發(fā)夾狀核酶的活性不是必需的,所以與此相對(duì)應(yīng)的RNA位點(diǎn)選擇不受此位點(diǎn)的限