氣道平滑肌被動(dòng)剛度和收縮力維持及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、哮喘?。ˋsthma）是目前世界上最常見的慢性呼吸道疾病之一，并已經(jīng)被公認(rèn)為是人類公共衛(wèi)生健康的重大威脅，但令人遺憾的是，我們至今還不能很好地解釋哮喘病的發(fā)病機(jī)理和發(fā)展過程。哮喘病最主要的病理學(xué)特征是氣道受到刺激之后的過度收縮反應(yīng)，又被稱為氣道的高反應(yīng)性(Airway Hyperresponsiveness, AHR)。氣道平滑肌作為主導(dǎo)氣道收縮的因素，它的力學(xué)行為及其收縮性能，包括其剛度，收縮力，力-速率關(guān)系等力學(xué)特性，對(duì)于氣道的力學(xué)

2、反應(yīng)和哮喘病研究具有重要的生理病理學(xué)意義，然而目前我們對(duì)于平滑肌力學(xué)性質(zhì)的了解目前還存在很大的空白，近期研究結(jié)果顯示，哮喘病人的氣道平滑肌在受到拉伸之后，維持收縮力和恢復(fù)收縮力的能力顯著高于健康人；另一方面，氣道平滑肌的剛度，作為調(diào)節(jié)氣道可擴(kuò)張性的重要因素，一直以來被作為哮喘研究的重要目標(biāo)。因此，本研究在眾多的氣道平滑肌力學(xué)性質(zhì)之中選擇了氣道平滑肌剛度和維持收縮力的能力作為研究方向，采用了氣道平滑肌組織，探索了剛度和維持收縮力作用以及其

3、背后的信號(hào)通路和超微結(jié)構(gòu)，主要的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1）氣道平滑肌剛度可以獨(dú)立于主動(dòng)收縮力被調(diào)控，而Rho激酶（ROCK）是調(diào)控這一機(jī)制的信號(hào)通路。為了觀察細(xì)胞骨架剛度的變化，我們建立了細(xì)胞膜透化的氣道平滑肌組織，分離了肌球蛋白磷酸化和主動(dòng)收縮對(duì)剛度產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)中搭配使用鈣離子和乙酰膽堿作為調(diào)控因子，觀察記錄并分析被動(dòng)剛度變化。結(jié)果表明細(xì)胞骨架剛度并非完全被動(dòng),在pCa=10-9的情況下10-4M乙酰膽堿仍然可以顯著提高

4、通透化平滑肌的剛度，更重要的是，在平滑肌剛度增加的同時(shí)，并沒有檢測(cè)到主動(dòng)收縮力的產(chǎn)生，肌肉繼續(xù)維持靜息張力，與此同時(shí)未偵測(cè)到任何肌球蛋白輕鏈（MLC20）磷酸化。進(jìn)一步研究顯示，ROCK抑制劑 H1152(1μM)完全沉默了這一被動(dòng)剛度變化，而調(diào)控主動(dòng)收縮過程的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抑制則對(duì)這一剛度反應(yīng)沒有影響。
　　2）氣道平滑肌維持收縮力的能力，特別是在收縮中對(duì)抗機(jī)械拉伸的機(jī)制是由ROCK通路調(diào)節(jié)的。為了研究平滑肌維持收

5、縮力的能力及其信號(hào)通路，本試驗(yàn)中使用了四種不同的抑制劑，分別是：蛋白激酶C（PKC）抑制劑GF109023x(15μM),肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）抑制劑 ML-7(5μM)，Rho激酶（ROCK）抑制劑Y27632(3μM)以及H1152(3μM)，這些抑制劑分別抑制了平滑肌收縮中最重要的三個(gè)通路。為了排除不同抑制劑對(duì)主動(dòng)收縮力的影響，試驗(yàn)中的每一組肌肉收縮力都通過不同濃度的抑制劑（實(shí)驗(yàn)組）或乙酰膽堿（對(duì)照組）匹配到50％的最大等長(zhǎng)

6、收縮力（Fmax）。實(shí)驗(yàn)記錄氣道平滑肌產(chǎn)生的等長(zhǎng)收縮力達(dá)到峰值之后100s內(nèi)維持等長(zhǎng)收縮力的能力，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示GF109023x以及ML-7沒有影響平滑肌維持等長(zhǎng)收縮力的能力，然而兩個(gè)不同的ROCK抑制劑都顯著的降低了平滑肌維持收縮力的能力。為了模擬深呼吸（DI）對(duì)氣道的舒張（Bronchodilation effect）作用，進(jìn)一步試驗(yàn)對(duì)正在收縮的平滑肌加入了25%Lref的機(jī)械拉伸，100s連續(xù)的周期拉伸數(shù)據(jù)顯示了和之前試驗(yàn)相似的數(shù)

7、據(jù)：對(duì)照組數(shù)據(jù)顯示平滑肌在第一個(gè)次牽拉之后收縮力對(duì)抗力學(xué)拉伸的反應(yīng)停留在一個(gè)穩(wěn)定的水平，GF109023以及ML-7的反應(yīng)與對(duì)照組相同，而Y27632和H1152顯著地抑制了氣道平滑肌在收縮中對(duì)抗力學(xué)拉伸的能力。進(jìn)一步研究集中于力學(xué)拉伸之后收縮力的恢復(fù)過程，數(shù)據(jù)表明只有ML-7沒有影響收縮力的恢復(fù)，而ROCK抑制劑和PKC抑制劑都顯著減緩了氣道平滑肌受到拉伸后恢復(fù)收縮力的能力。
　　3）氣道平滑肌維持收縮力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是肌球蛋白的聚

8、合，而ROCK是調(diào)控這一過程的信號(hào)通路。為了研究氣道平滑肌維持收縮力和在收縮過程中對(duì)抗機(jī)械拉伸能力的超微結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并研究調(diào)節(jié)該結(jié)構(gòu)變化的機(jī)制，試驗(yàn)同時(shí)使用了 ROCK抑制劑Y27632和PKC抑制劑GF109023x，我們?cè)诩∪膺_(dá)到收縮力峰值時(shí)固定組織并做肌肉橫截面的電鏡超薄切片，取得圖像后分析不同實(shí)驗(yàn)組的肌球蛋白絲密度。結(jié)果顯示在等長(zhǎng)收縮力峰值相同的前提下，GF109023x抑制組和對(duì)照組的肌球蛋白重鏈密度沒有顯著差異，而ROCK通路