中藥甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　宮血寧膠囊（GXN）是利用云南省道地中藥材重樓開發(fā)的總甾體皂苷(TSSPs)制劑，目前已成為國(guó)內(nèi)婦科專家首推的治療婦科血癥的中成藥制劑。在既往的研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GXN能夠增強(qiáng)子宮收縮和促凝血功能是治療異常子宮出血(AUB)的兩個(gè)關(guān)鍵藥效學(xué)基礎(chǔ)，并通過植化研究鑒定出十余種甾體皂苷，進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析確定了具有螺甾結(jié)構(gòu)的偏諾類皂苷具有顯著的促子宮平滑肌收縮活性，并且研究證實(shí)了單體Tg引起大鼠血小板聚集、促進(jìn)凝血的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通

2、路。然而，甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮的藥理學(xué)作用，尤其是作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不十分清楚。本研究的目的在于探索中藥甾體皂苷誘導(dǎo)子宮平滑肌收縮的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，明確甾體皂苷縮宮作用機(jī)制，為尋找作用靶點(diǎn)以及藥物的二次開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　內(nèi)容：
　　明確偏諾皂苷Tg誘導(dǎo)的大鼠子宮平滑肌收縮與MLC20磷酸化的關(guān)系;探討PLC-IP3、RhoA/ROK、ERK/MAPK、P38/MAPK、JNK/SAPK和PKC等可能通路的參與與否

3、以及通路間的相互作用;構(gòu)畫Tg引起子宮平滑肌收縮的分子機(jī)制圖。
　　方法：
　　選用120～140g的雌性SD大鼠、采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代大鼠子宮平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng);利用離體子宮平滑肌收縮實(shí)驗(yàn)研究Tg的體外效應(yīng)和各種抑制劑對(duì)Tg作用的影響;采用蛋白免疫印跡(Western blotting)技術(shù)檢測(cè)可能涉及的信號(hào)通路中信號(hào)蛋白肌球蛋白輕鏈(MLC20)、ERK、p38、JNK和鈣調(diào)結(jié)合蛋白(CaD)的磷酸化改變;利用細(xì)

4、胞內(nèi)鈣離子標(biāo)記、激光共聚焦檢測(cè)平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
　　結(jié)果：
　　1.Tg引起子宮平滑肌收縮效應(yīng)的確定以及收縮與MLC20磷酸化效應(yīng)的關(guān)系
　　從總甾體皂苷(TSSPs)中分離提取的單體化合物Tg具有顯著的促子宮平滑肌收縮作用，作用的起始濃度為1.25μM，隨著給藥濃度的增加，收縮效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。已知生理狀態(tài)下平滑肌細(xì)胞內(nèi)p-MLC20表達(dá)水平與平滑肌收縮密切相關(guān)，為了揭示Tg誘導(dǎo)的大鼠子宮平滑肌收縮作用是否

5、與平滑肌細(xì)胞內(nèi)MLC20磷酸化關(guān)聯(lián)，采用western blotting技術(shù)評(píng)價(jià)Tg刺激后胞內(nèi)MLC20磷酸化水平的改變，發(fā)現(xiàn)Tg能夠呈劑量和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)組織細(xì)胞內(nèi)p-MLC20表達(dá)水平的升高。MLC20磷酸化反應(yīng)通常由MLCK介導(dǎo)，應(yīng)用MLCK特異性抑制劑ML-7能夠顯著抑制Tg誘導(dǎo)的MLC20磷酸化以及子宮平滑肌收縮。而MLCK主要通過活化的CaM來(lái)激活，應(yīng)用CaM特異性抑制劑W-7也能顯著抑制Tg誘導(dǎo)的p-MLC20水平升高及子

6、宮平滑肌收縮效應(yīng)。
　　2.平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i對(duì)MLC20磷酸化和Tg縮宮作用的影響
　　為了驗(yàn)證[Ca2+]i在Tg引起子宮平滑肌收縮以及MLC20磷酸化效應(yīng)中的角色，研究首先從檢測(cè)[Ca2+]i水平的改變?nèi)胧?。?.5μM Tg刺激預(yù)先以Fluo4-AM共孵育的子宮平滑肌細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下可見Tg刺激后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著性增高，作用12s出現(xiàn)熒光強(qiáng)度的峰值，持續(xù)1-2s后很快下降，提示Tg能夠刺激子宮平滑肌

7、細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i瞬時(shí)升高，形成“鈣振蕩”。去除細(xì)胞外鈣或利用L型鈣離子通道阻斷劑尼群地平以阻斷外鈣內(nèi)流，或利用thapsigargin內(nèi)鈣耗竭劑阻斷內(nèi)鈣釋放，都能顯著抑制Tg誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮以及p-MLC20水平的升高。應(yīng)用PLC/IP3信號(hào)通路的特異性抑制劑幾乎完全抑制Tg的縮宮作用以及p-MLC20水平升高。另外，Rethunium Red(蘭尼堿受體(RYR)的特異性阻滯劑）能夠阻止鈣離子與受體的結(jié)合，從而抑制Ca2+引發(fā)

8、的Ca2+釋放(CICR)，應(yīng)用54μ M Rethunium Red能抑制Tg縮宮作用的發(fā)揮。
　　3.RhoA/ROK信號(hào)通路在Tg縮宮機(jī)制中的調(diào)節(jié)作用
　　RhoA/ROK信號(hào)通路的激活可以通過使MLCP失活而提高p-MLC20濃度。應(yīng)用ROK特異性抑制劑Y27632的既能夠抑制Tg引起的子宮平滑肌收縮，也能抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)p-MLC20升高。
　　4.ERK/MAPK信號(hào)通路在Tg誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮中的調(diào)節(jié)作

9、用MEK特異性抑制劑U0126能夠抑制Tg誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮，主要表現(xiàn)為收縮頻率的降低;并且，Tg呈劑量和時(shí)間依賴地引起子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平的升高，這一效應(yīng)能夠被U0126完全抑制;Tg還能引起CaD的磷酸化效應(yīng)增強(qiáng)，可以被U0126部分抑制。為了驗(yàn)證ERK/MAPK通路的激活是否由ras/raf途徑介導(dǎo)，檢測(cè)raf蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)Tg尚能夠引起平滑肌細(xì)胞內(nèi)p-c-Raf表達(dá)的升高，具有時(shí)間依賴性;而應(yīng)用ras阻斷劑可

10、以抑制Tg誘導(dǎo)p-ERK1/2升高。
　　5.p38/MAPK和JNK/SAPK信號(hào)通路在Tg誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮中的調(diào)節(jié)作用
　　已有研究表明在其他平滑肌組織中p38/MAPK和JNK/SAPK信號(hào)通路參與收縮調(diào)節(jié)。我們的研究提示，Tg能夠誘導(dǎo)子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)p-p38和p-JNK水平的升高，效應(yīng)具有時(shí)間和劑量依賴性。此外，在Tg引起子宮平滑肌收縮后給予p38通路抑制劑SB203580或JNK抑制劑SB600125均能抑制

11、Tg的促收縮效應(yīng)以及CaD磷酸化效應(yīng)。
　　6.參與調(diào)節(jié)Tg引起子宮平滑肌收縮的信號(hào)通路間相互交叉
　　通過各種抑制劑的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)ras/raf/ERK/MAPK信號(hào)通路不僅能夠引起ERK1/2磷酸化，同時(shí)也能促進(jìn)p-MLC20的產(chǎn)生;引起p-MLC20升高的PLC/IP3信號(hào)通路的激活也能引起p-ERK1/2表達(dá)水平的升高，而給予CaM抑制劑W-7和MLCK抑制劑ML-7對(duì)Tg的促ERK1/2磷酸化效應(yīng)幾乎無(wú)影響;0.4μ

12、M的PKC抑制劑GFX能夠顯著抑制Tg引起的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2水平的升高，提示Tg引起的PLC/IP3通路的激活不僅使p-MLC20表達(dá)升高，還有可能通過PKC途徑介導(dǎo)產(chǎn)生p-ERK1/2水平的升高。
　　結(jié)論：
　　以代表化合物Tg作為分子探針研究多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中藥甾體皂苷引起子宮平滑肌收縮中的作用機(jī)制，我們首次發(fā)現(xiàn):參與甾體皂苷縮宮作用調(diào)節(jié)涉及多個(gè)信號(hào)通路的激活、形成通路網(wǎng)絡(luò)，可能存在多個(gè)作用靶點(diǎn)。一方

13、面，Tg的縮宮作用與p-MLC20表達(dá)水平升高密切相關(guān)。Tg通過激活子宮平滑肌細(xì)胞膜鈣離子通道引起外鈣內(nèi)流以及PLC/IP3信號(hào)通路引起內(nèi)鈣釋放使平滑肌細(xì)胞[Ca2+]i提高而升高p-MLC20水平;RhoA/ROK信號(hào)通路的激活不依賴[Ca2+]i，通過使MLCP失活而提高p-MLC20濃度，起到鈣增敏作用，最終引起子宮平滑肌的收縮。Ca2+引發(fā)的Ca2+釋放(CICR)機(jī)制也參與[Ca2+]i的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)Tg的縮宮效應(yīng)。另一方面，T