他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的:
　　 通過(guò)檢測(cè)新型免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus)對(duì)黑素細(xì)胞(melanocyte,MC)和角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)的作用,觀察他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞的直接和間接影響,尋找其作用靶點(diǎn),以揭示他克莫司治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制,從而為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),使之更好地服務(wù)于臨床。
　　 方法:
　　 1.建立小鼠B16黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系,并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板,選

2、擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以不同濃度的他克莫司(10,102,103,104 nmol/L)對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照組。觀察他克莫司對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的影響并檢測(cè)黑素細(xì)胞增殖(MTT法)、遷移(微孔膜法)、酪氨酸酶活性(多巴氧化法)、黑素含量(NaOH裂解法)等指標(biāo)。
　　 2.建立人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)培養(yǎng)體系,并根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板,選擇對(duì)

3、數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以不同濃度的他克莫司(10,102,103,104nmol/L)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照組,培養(yǎng)48小時(shí)后,收集上清液。采用ELISA法檢測(cè)上清液中干細(xì)胞因子(SCF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的含量,并測(cè)定角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況。收集角質(zhì)形成細(xì)胞和小鼠B16黑素瘤細(xì)胞,提取RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞SCF mRNA、黑素細(xì)胞c-kitmRNA的表達(dá)

4、水平。
　　 3.以他克莫司作用后的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件化培養(yǎng)基對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)黑素細(xì)胞的增殖(MTT法)、酪氨酸酶活性(多巴氧化法)、黑素含量(NaOH裂解法)等指標(biāo),以觀察他克莫司通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的間接作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.低濃度(10nmol/L和102nmol/L)他克莫司對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響不明顯,高濃度(103nmol/L和104nmol/L)對(duì)增殖有

5、抑制作用。各濃度他克莫司均可提高黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性并增加黑素含量。此外,他克莫司可以促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移。
　　 2.低濃度(10nmol/L和102nmol/L)他克莫司對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖影響不明顯,高濃度(103nmol/L和104nmol/L)對(duì)增殖有抑制作用。在適當(dāng)濃度的他克莫司作用下,角質(zhì)形成細(xì)胞分泌SCF的含量增加,但對(duì)bFGF含量無(wú)明顯影響。他克莫司能上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞SCF mRNA和黑素細(xì)胞c-kit mRN

6、A的表達(dá)。
　　 3.不同濃度他克莫司作用后的角質(zhì)形成細(xì)胞條件化培養(yǎng)基能明顯促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖,但酪氨酸酶活性和黑素細(xì)胞含量與對(duì)照組相比較變化不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 他克莫司可以通過(guò)促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移、提高酪氨酸酶活性、增加黑素含量等環(huán)節(jié)直接作用于黑素細(xì)胞,產(chǎn)生復(fù)色；他克莫司還可以通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子SCF進(jìn)而改變黑素細(xì)胞生存的微環(huán)境,產(chǎn)生復(fù)色,從而揭示了他克莫司