非霍奇金淋巴瘤代謝組學(xué)研究及氨基糖苷類(lèi)抗生素質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)的發(fā)病率正逐年增長(zhǎng)，目前已成為我國(guó)發(fā)病率第9位的惡性腫瘤。對(duì)于淋巴瘤的早期診斷與早期治療將會(huì)明顯改善病人的生存期，提高淋巴瘤患者的生存率，但是目前仍無(wú)特異性的早期診斷方法。
　　代謝組學(xué)技術(shù)從系統(tǒng)水平研究機(jī)體小分子代謝物變化規(guī)律，疾病診斷是其重要應(yīng)用領(lǐng)域之一。對(duì)于由疾病引起的代謝產(chǎn)物的變化響應(yīng)進(jìn)行代謝組學(xué)分析，能夠幫助人們從代謝下游的角度了解病變過(guò)程及體內(nèi)物質(zhì)的

2、代謝途徑，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，并輔助臨床診斷。
　　本論文首先應(yīng)用以超高效液相色譜-單四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-QTOFMS）和氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(GC-TOFMS)為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)，從整體上考察非霍奇金淋巴瘤患者和正常人血清及尿液樣本間的代謝譜差異?；诒痉椒ǖ玫降难迮c尿液代謝輪廓可以明顯揭示出非霍奇金淋巴瘤患者和正常人之間的代謝表型差異。再結(jié)合多維模式識(shí)別技術(shù)以及單維統(tǒng)計(jì)分析，能夠有效地尋找出非霍

3、奇金淋巴瘤患者和健康對(duì)照組之間的血清、尿液差異代謝物。鑒定出總共41個(gè)濃度變化具有顯著差異的代謝物，并且從中進(jìn)一步篩選出了4個(gè)關(guān)鍵代謝標(biāo)志物，在受試者工作特征曲線(ROC)分析中，曲線下面積(AUC)達(dá)到1，具有很高的診斷準(zhǔn)確性，為將來(lái)全面理解非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和一個(gè)新的視角，并為提高癌癥早期診斷率提供依據(jù)。
　　氨基糖苷類(lèi)抗生素是臨床上常用的抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性好以及吸收排泄

4、良好的特點(diǎn)。但由于該類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)中缺乏紫外吸收基團(tuán)，因此，目前各國(guó)藥典中多采用柱前衍生化的高效液相色譜法、電化學(xué)檢測(cè)法或者微生物檢定法測(cè)定含量。本文分別建立了3種氨基糖苷類(lèi)抗生素原料藥的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，可以同時(shí)完成對(duì)主成分含量的測(cè)定及各有關(guān)物質(zhì)的檢查。方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便易行，為氨基糖苷類(lèi)抗生素原料藥及其制劑的含量測(cè)定、質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了方法參考。
　　本課題的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.采用基于UP

5、LC-QTOFMS技術(shù)的代謝組學(xué)方法結(jié)合多維/單維統(tǒng)計(jì)分析研究了非霍奇金淋巴瘤患者和正常對(duì)照者的血清代謝譜的差異。本結(jié)果表明，利用非監(jiān)督的PCA方法，能得到非霍奇金淋巴瘤患者與正常人代謝譜分離的趨勢(shì)，進(jìn)一步利用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)的方法能清晰地發(fā)現(xiàn)非霍奇金淋巴瘤病人與正常對(duì)照之間的代謝輪廓的差異。通過(guò)采用多種篩選標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合的思路對(duì)差異性代謝物進(jìn)行了選定與鑒定，發(fā)現(xiàn)10個(gè)重要差異代謝物表征了與非霍奇金淋巴瘤相

6、關(guān)的代謝通路變化，確認(rèn)與該疾病密切相關(guān)的通路變化包括花生四烯酸代謝、類(lèi)固醇代謝、膽汁酸代謝、氨基酸代謝、糖代謝及卟啉代謝。本結(jié)果不但為監(jiān)測(cè)疾病狀況下體內(nèi)重要代謝物的變化提供了堅(jiān)實(shí)可靠的依據(jù)，同時(shí)也為今后治療淋巴瘤的藥物靶點(diǎn)的尋找提供了可能。
　　2.采用UPLC-QTOFMS技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別的方法研究了正常人和非霍奇金淋巴瘤患者的尿液代謝譜的區(qū)別。結(jié)果表明，非霍奇金淋巴瘤患者與正常對(duì)照之間的代謝輪廓存在明顯差異，通過(guò)采用多維與單維

7、統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的篩選方法對(duì)顯著性代謝差異物進(jìn)行了選定和鑒定，共得到了26個(gè)差異性代謝物。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)與正常人相比，非霍奇金淋巴瘤患者的煙酸和煙酰胺代謝、組氨酸代謝、色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、嘌呤代謝、嘧啶代謝、谷氨酸代謝等代謝過(guò)程發(fā)生了不同程度的紊亂。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)單維分析篩選出的同型半胱氨酸、2-（2-苯基乙酰氧基）丙甘氨酸、L-蘋(píng)果酸和L-抗壞血酸，經(jīng)邏輯回歸算法擬合為一個(gè)綜合變量后，可對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤與T細(xì)胞淋巴瘤患者實(shí)行有效區(qū)分，

8、在ROC分析中，AUC達(dá)到0.900。
　　3.建立了基于N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)衍生的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOFMS)的分析技術(shù)和模式識(shí)別方法，探討了非霍奇金淋巴瘤患者和正常人血清的代謝譜差異。結(jié)合多維及單維統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)非霍奇金淋巴瘤患者血清樣本中相關(guān)小分子內(nèi)源性代謝物濃度發(fā)生了明顯變化，找到對(duì)分組貢獻(xiàn)較大的5個(gè)差異性代謝物:苯基丁酸、3-羥基-2-氧代丙酸、(2R)-2-羥基辛酸、丙酮酸和

9、L-絲氨酸。并且本實(shí)驗(yàn)中提供的信息與UPLC-MS的相互補(bǔ)。通過(guò)差異物的比較發(fā)現(xiàn)與正常人相比，非霍奇金淋巴瘤患者在甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、直鏈脂肪酸代謝、糖酵解、三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路上發(fā)生了較顯著的改變。該結(jié)果為探究非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病機(jī)理提供了代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，將有助于相關(guān)篩查方法與治療手段的改進(jìn)和完善。
　　4.將UPLC-QTOFMS和GC-TOFMS兩種分析儀器所選鑒出的，在非霍奇金淋巴瘤患

10、者和正常人體內(nèi)相對(duì)含量具有顯著性差異的潛在標(biāo)志物進(jìn)行整合，并進(jìn)一步挑選得到具有標(biāo)志代謝物組作用的4個(gè)關(guān)鍵代謝物，2，3-DINOR-6，15-二酮-13，14-二氫-前列腺素F1a、2-花生四烯酸甘油酯、苯基丁酸和3-羥基-2-氧代丙酸，在正常對(duì)照與B細(xì)胞淋巴瘤、正常對(duì)照與T細(xì)胞淋巴瘤的ROC分析中，AUC都達(dá)到了1，具有很高的診斷準(zhǔn)確率。此結(jié)果不但為監(jiān)控疾病進(jìn)展?fàn)顩r提供了堅(jiān)實(shí)、可靠的依據(jù)，同時(shí)也為今后治療淋巴瘤疾病的藥物靶點(diǎn)的尋找提供

11、了有針對(duì)性的方向。
　　5.分別建立3種氨基糖苷類(lèi)抗生素——鹽酸大觀霉素、硫酸阿米卡星及硫酸鏈霉素的HPLC-ELSD質(zhì)量控制方法。具有快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和回收率穩(wěn)定、流動(dòng)相中酸性離子對(duì)試劑以及有機(jī)溶劑用量少等特點(diǎn)，使分析成本大大降低，便于在廣大藥廠及藥檢部門(mén)中進(jìn)行推廣。
　　本論文的內(nèi)容覆蓋了不同生物樣本及分析平臺(tái)的非霍奇金淋巴瘤代謝組學(xué)應(yīng)用研究，其結(jié)果對(duì)拓展代謝組學(xué)的研究范圍起到了推動(dòng)作用;同時(shí)，對(duì)于非霍奇金淋巴瘤早期診