造血干細胞體內衰老模型的構建及相關生物學研究.pdf

1、目的：
　　 生、老、病、死是生命的自然規(guī)律。衰老是機體發(fā)育成熟以后伴隨著時間的推移體內各種細胞、組織與器官逐漸發(fā)生結構和功能不可逆轉的、全面的衰退過程。最新研究認為：生物體的衰老實際上是其體內干細胞的衰老，所有的衰老現象包括組織器官退化、功能喪失、腫瘤發(fā)生和反復感染等都是成體干細胞衰老水平的具體表現。因此，深入研究干細胞衰老的機理對預防和治療老年性疾病有重要理論意義與臨床應用價值。
　　 實驗證明，造血干細胞（HSC）

2、的衰老與機體衰老有著密切的關系。HSC衰老是指細胞生長停滯，不可逆的停留在GI期，自我更新和多向分化能力降低，細胞數量減少，應激性凋亡升高。HSC衰老可以引起機體造血功能和免疫功能的衰退、腫瘤發(fā)生率增加，并導致機體重要臟器結構與功能的衰退。目前對HSC衰老機理還了解甚少，如果能闡明HSC衰老的生物學機理，尋找到延緩其衰老途徑，無疑對防治老年性疾病有重要的理論意義和臨床應用價值。衰老模型的構建與相關生物學檢測是研究HSC衰老機理的重要基礎

3、性工作，迄今仍未見理想和公認的HSC體內衰老模型。本研究以C57小鼠為研究對象，采用雄性供體HSC連續(xù)性移植建立小鼠的HSC復制性衰老的體內模型，并通過整體、細胞和分子水平對HSC衰老的生物學特性進行檢測，旨在為研究HSC衰老機理以及延緩其衰老的途徑提供理論與實驗依據。
　　 方法：
　　 1.免疫磁性分選法（MACS）分離、純化雄性C57小鼠Sca-1+HSC，流式細胞術（FCM）鑒定分選細胞純度，免疫熒光檢測分選HS

4、C Sca-1+抗原的表達，臺盼藍拒染法檢測分選Sca-1+HSC的活性。
　　 2.用雄性供體HSC連續(xù)尾靜脈移植給雌性受體鼠，建立小鼠HSC復制性衰老體內模型；經PCR分析Y染色體基因，鑒定受體鼠造血細胞是否來源于雄性供體；觀察移植后受體鼠脾結節(jié)（CFU-S）形成數量、測定脾臟指數，胸腺指數，觀察移植HSC后受體鼠外周血血象指標（WBC，RBC以及PLT）的恢復，以觀察受體鼠造血功能重建情況。
　　 3.采用造血祖細

5、胞混合性集落（CFU-Mix）培養(yǎng)、細胞周期測定和衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β）染色，觀察連續(xù)移植所致衰老HSC自我更新和多向分化能力的生物學特點。
　　 結果：
　　 1.小鼠Sca-1+HSC分離純化及鑒定
　　 流式細胞術檢測MACS前骨髓單個核細胞（MNCs）中Sca-1+HSC百分比僅為1.7％；MACS分離純化后Sca-1+HSC純度可達87.2％以上。免疫熒光觀察顯示，分選前MNCs中僅有極少數

6、細胞表達Sca-1+抗原，MACS分離純化后標記的細胞中見大多數細胞表達Sca-1+抗原。臺盼藍拒染法檢測分選的Sca-1+HSC活性為96％～99％。提示分選的Sca-1+細胞有較高純度和活性。
　　 2.供體HSC連續(xù)移植后受體鼠脾結節(jié)、脾臟指數、胸腺指數及外周血
　　 血象檢測
　　 2.1雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，其在受體小鼠脾臟上形成CFU-S的能力下降。
　　 2.2雄性供體HSC連續(xù)移植

7、2次后，受體小鼠的脾臟和胸腺重量減輕，脾臟指數與胸腺指數皆有明顯下降。
　　 2.3雄性供體HSC連續(xù)移植2次后，受體小鼠WBC，RBC、PTC以及HCT均有所降低，提示在連續(xù)移植中HSC的自我更新及重建造血的能力下降。
　　 3.Y染色體檢測
　　 經Y染色體PCR分析，結果顯示受體鼠的造血細胞均能檢測出342bp的Y染色體序列（Sry序列），證明雌性受體小鼠重建造血的細胞來源于雄性供體小鼠HSC。
　　

8、 4.連續(xù)移植所致HSC衰老的生物學檢測
　　 4.1隨著HSC連續(xù)移植代數的增加，其形成CFU-Mix集落數量和形成集落的細胞數明顯降低。
　　 4.2隨著HSC連續(xù)移植代數的增加，細胞出現G1期阻滯，其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少。
　　 4.3隨著HSC連續(xù)移植代數的增加，SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞百分比明顯增高。
　　 結論：
　　 1.采用MACS能成功、有效的分離、純化雄