bcl-2在抗鎘致大鼠原代近曲小管細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、鎘(Cd)是重要的工業(yè)和環(huán)境污染物之一,可由食物鏈和飲用水進(jìn)入人體,對(duì)機(jī)體腎、肝、肺、睪丸、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性,其中腎臟是其損害的主要靶器官。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)鎘誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡的研究較少,而且其機(jī)制至今也尚未清楚。因此,本課題通過用攜帶bcl-2基因的重組腺病毒(由增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記)感染原代SD大鼠近曲小管細(xì)胞,研究Bcl-2蛋白在鎘致細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。為進(jìn)一步研究鎘對(duì)腎毒性的機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。
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2、 SD大鼠腎近曲小管細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的建立
　　 本實(shí)驗(yàn)采用三種分離方法對(duì)SD大鼠腎近曲小管細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。它們分別是:機(jī)械研磨組織培養(yǎng)法(A法)、機(jī)械研磨加0.125％胰酶-0.02％EDTA消化法(B法)、機(jī)械研磨加1g/L的膠原酶Ⅰ消化法(C法)。含有10％的胎牛血清、5 ng/mL EGF、100 U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液,培養(yǎng)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱。
　　 通過對(duì)三種培養(yǎng)方

3、法的比較分析結(jié)果如下:A法,細(xì)胞36 h后始見有細(xì)胞從組織中伸出,細(xì)胞團(tuán)塊較多,貼壁量少,貼壁率30％,細(xì)胞生長(zhǎng)不良,體積大小不一;B法,細(xì)胞24 h左右貼壁生長(zhǎng),但貼壁生長(zhǎng)量較少,貼壁率40％,細(xì)胞生長(zhǎng)不整齊;C法,細(xì)胞于24 h左右即可見到貼壁生長(zhǎng),貼壁率70％,細(xì)胞基本能長(zhǎng)滿培養(yǎng)板,形態(tài)為多邊形,體積較大,細(xì)胞團(tuán)塊周圍生長(zhǎng)出大量的細(xì)胞。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),C法是三種方法中最好的,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和細(xì)胞產(chǎn)量均好于其他兩法。
　　

4、 2 bcl-2重組病毒滴度的測(cè)定及對(duì)原代近曲小管細(xì)胞的感染
　　 將攜帶bcl-2基因的重組腺病毒(EGFP標(biāo)記)在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增,收集病毒原液。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HEK293細(xì)胞以90μL/孔(1×105/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h。分15組,每組2孔。每組加10μL/孔病毒液,濃度分別是:1、1/10、1/102、1/1031/1013病毒原液,最后一組為空白對(duì)照。培養(yǎng)20 h后,在熒光倒置顯微鏡下觀察產(chǎn)

5、生綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量,確定計(jì)量孔(熒光細(xì)胞數(shù)少于5個(gè))為第9孔(計(jì)為1 U);根據(jù)公式10:1稀釋的病毒滴度=1 U×10n-1/0.01 mL=10n+1PFU/mL,計(jì)算得到病毒滴度為1010 PFU/mL。以不同感染復(fù)數(shù)(MOI,MOI=病毒滴度×加入的病毒體積/近曲小管細(xì)胞數(shù))的重組腺病毒感染原代近曲小管細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察,24 h后MOI≥50感染的細(xì)胞有熒光,說明腺病毒成功感染腎近曲小管細(xì)胞。3鎘致原代細(xì)胞凋亡及腺病毒

6、介導(dǎo)的Bcl-2蛋白對(duì)其抑制作用的研究
　　 研究Bcl-2蛋白的抗鎘致原代腎近曲小管細(xì)胞凋亡的特性。用含有及不含有bcl-2基因的重組腺病毒感染SD大鼠原代腎近曲小管細(xì)胞(Proximal tubulecells,PTC)。即PTC+Ad-bcl-2-EGFP,PTC+Ad-EGFP,PTC三組,同時(shí)設(shè)定氯化鎘濃度梯度和作用時(shí)間梯度刺激細(xì)胞,經(jīng)MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化、AO/EB雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率的變化、DNA Ladder