KIF5B-RET融合基因功能及相關(guān)藥物干預(yù)研究.pdf

1、目的:肺癌是全世界范圍死亡率最高的腫瘤。近年來，靶向治療成為肺癌研究的熱點(diǎn)。越來越多分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及靶向藥物的研發(fā)給肺癌患者長(zhǎng)期生存帶來了希望。但是，只有特定基因型的患者才能從相應(yīng)靶向藥物治療中獲益。因此，為使更多的患者從靶向治療中獲益，對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者群體進(jìn)行精確的分子亞型區(qū)分，成為了肺癌靶向治療成功的重要條件。2012年研究發(fā)現(xiàn)肺癌中存在一種新的融合基因KIF5B

2、-RET，其陽性患者多為不吸煙或很少吸煙的腺癌患者。其存在與其他已知的基因改變?nèi)鏓GFR、K-Ras、EML4-ALK等相互排斥，提示KIF5B-RET是一種新的致癌驅(qū)動(dòng)突變，有可能成為非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化診斷與治療的一個(gè)分子靶點(diǎn)。KIF5B-RET融合基因的功能性研究目前尚不深入，其基因功能有待深入探討。本研究主要應(yīng)用慢病毒感染的手段構(gòu)建KIF5B-RET融合基因陽性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并初步探討KIF5B-RET融合基因?qū)?xì)胞在增殖、遷移

3、、凋亡方面的影響。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用分段PCR法分別擴(kuò)增出KIF5B基因片段和RET基因片段，分別載入載體質(zhì)粒后，與pCDH-CMV-MCS慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行連接后獲得載有完整KIF5B-RET基因片段的質(zhì)粒，并進(jìn)行慢病毒的包裝和生產(chǎn)，轉(zhuǎn)染BEAS2B肺上皮細(xì)胞后進(jìn)行RT-PCR和Western blot鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)KIF5B-RET融合基因細(xì)胞株。采用CCK8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，transwell法檢測(cè)細(xì)

4、胞遷移能力，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，western blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白激活及藥物抑制情況。
　　結(jié)果: RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示KIF5B-RET-PCDH（KV2亞型）及KIF5B-RET4-PCDH（KV4亞型）慢病毒轉(zhuǎn)染BEAS2B細(xì)胞后兩種KIF5B-RET融合基因mRNA表達(dá)明顯，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示兩種KIF5B-RET融合蛋白表達(dá)明顯，說明BEAS2B-KIF5B-R

5、ET工具細(xì)胞構(gòu)建成功?；蜣D(zhuǎn)染組在正常培養(yǎng)情況下對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響，但在減血清濃度(5％)的情況下增殖情況有差異?；蜣D(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比遷移能力增強(qiáng)。在減血清及加入順鉑凋亡誘導(dǎo)劑的情況下實(shí)驗(yàn)組顯示出抗凋亡的能力。Western blot結(jié)果顯示多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼對(duì)KIF5B-RET蛋白具有抑制作用，并可以抑制其下游信號(hào)通路的激活。
　　結(jié)論:1.KIF5B-RET融合基因?qū)?xì)胞有抗凋亡的作用。
　　2.KIF5B