利用VIGS技術(shù)對(duì)草莓FaMYB5基因功能的研究.pdf

1、病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一種自然機(jī)制，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。是目前開發(fā)的一種反向遺傳學(xué)新技術(shù)，在動(dòng)植物功能基因組學(xué)研究方面得到廣泛應(yīng)用。
　　類黃酮化合物(Flavonids)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物之一，在植物界中分布廣泛且具有較強(qiáng)的生物活性，不僅有益人類身體健康還影響植物花器官發(fā)育和果實(shí)著色等。草莓（Fragaria×ananassa.D

2、uch.）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)含高濃度的類黃酮化合物，具有重要的保健功能和顯著的經(jīng)濟(jì)效益，因此倍受消費(fèi)者和種植者的喜愛。目前，草莓類黃酮化合物代謝途徑中主要結(jié)構(gòu)基因已被認(rèn)知，但是該途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息卻知之甚少。大量研究表明，類黃酮化合物花青素苷、原花青素等代謝途徑均受MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。因此利用VIGS技術(shù)快速鑒定黃酮化合物代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能，揭示在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)草莓黃酮類物質(zhì)代謝途徑的調(diào)控機(jī)理，對(duì)改善草莓的品質(zhì)，以及

3、其他園藝作物的遺傳改良，具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　本研究以草莓‘豐香’(Fragaria×ananassa cv.Toyonaka)為材料。利用VIGS技術(shù)對(duì)草莓果實(shí)中類黃酮化合物代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FaMYB5基因進(jìn)行沉默，并對(duì)該基因沉默后類黃酮化合物途徑相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)沉默后果實(shí)中花青素苷和原花青素的含量進(jìn)行測(cè)定，以期全面探明草莓中FaMYB5基因?qū)︻慄S酮化合物代謝途徑的調(diào)控作用及其機(jī)制，揭示其功能。主要得到以

4、下研究結(jié)果:
　　1.采用改良的CTAB法提取草莓不同組織及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中已登錄的森林草莓MYB5基因序列(JQ989280.1)，同源克隆FaMYB5基因全長(zhǎng)編碼序列(Full Coding Sequences，CDS);序列分析表明:該基因CDS區(qū)共832bp，編碼273個(gè)氨基酸，與森林草莓的MYB5同源性達(dá)97％。其蛋白結(jié)構(gòu)中缺少R2結(jié)構(gòu)域，因此FaMYB5轉(zhuǎn)錄因子更類似

5、R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，并且其R3重復(fù)單元中存在與bHLH因子互作作用相關(guān)的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R序列。
　　2.采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)FaMYB5在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)情況。研究結(jié)果表明: FaMYB5基因在草莓果實(shí)發(fā)育的6個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)量存在差異。從整體趨勢(shì)看，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，F(xiàn)aMYB5基因的表達(dá)是逐漸上升的。在果實(shí)的小綠期(SG)，F(xiàn)aMYB5基

6、因的表達(dá)量最低。但是在白果期（White）出現(xiàn)一個(gè)降低的峰值，其表達(dá)量略高于小綠期，之后草莓果實(shí)開始轉(zhuǎn)紅時(shí)其表達(dá)量又逐漸上升，在果實(shí)全紅期(FR)達(dá)到最大，說明FaMYB5與類黃酮化合物代謝有關(guān)。
　　3.構(gòu)建VIGS載體pTRV-FaMYB5，通過注射法侵染草莓果實(shí)，導(dǎo)致果實(shí)內(nèi)源FaMYB5基因沉默建立草莓VIGS體系。觀察FaMYB5沉默后‘豐香’草莓果實(shí)的表觀變化，采用半定量RT-PCR和qRT-PCR的方法檢測(cè)FaMYB5

7、基因的沉默效率，結(jié)果顯示FaMYB5基因沉默效率達(dá)60％，成功構(gòu)建了pTRV2-FaMYB5的VIGS重組載體及草莓VIGS體系。
　　4.采用半定量RT-PCR和qRT-PCR測(cè)定FaMYB5沉默后草莓類黃酮化合物代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)量，同時(shí)分別采用HPLC和DMACA化學(xué)反應(yīng)法對(duì)FaMYB5沉默后果實(shí)中的花青素苷和原花青素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:該基因沉默后，F(xiàn)aANS的表達(dá)量及花青素苷含量降低，而FaLAR、FaANR和FaM

8、YB9表達(dá)量均增加，從而導(dǎo)致果實(shí)中原花青素含量增加。綜合分析表明:FaMYB5是通過與FaMYB9轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)bHLH3蛋白結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制TTGI-FaMYB9-bHLH3三元復(fù)合體的活性，間接調(diào)控FaLAR/FaANR基因的表達(dá)。從分子和生理兩方面的研究表明:FaMYB5轉(zhuǎn)錄因子是草莓類黃酮化合物代謝途徑中的原花青素合成途徑中的負(fù)調(diào)控因子。
　　5.研究發(fā)現(xiàn)FaMYB5基因沉默后FabHLH3、bHLH3△基因的表達(dá)量