HMGB1參與實驗性急性肝、肺損傷的作用及其機制.pdf

1、肝臟疾病（如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精肝、肝纖維化及肝硬化等）嚴重危害人類健康。免疫性損傷是導(dǎo)致肝臟疾病的重要因素之一。Con A所致肝損傷模型由于其病理特征類似于人急性肝炎，被認為是研究人類病毒性肝炎和自身免疫性肝病的可靠模型。Con A與肝細胞膜有極強親和性，注入體內(nèi)后大量聚集于肝臟，招募并激活多克隆T細胞，并促進其釋放多種細胞因子（如TNF-ａ和IFN-γ），導(dǎo)致肝細胞損傷。
　　 高遷移率族蛋白B1（high mo

2、bility group box，HMGB1）是一種核內(nèi)蛋白，其分子含與DNA結(jié)合的2個結(jié)構(gòu)域A-box和B-box，以及一個高度重復(fù)并富含酸性氨基酸的C-末端。HMGB1 核內(nèi)功能主要是使雙螺旋極度扭曲以便各種轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)相互作用，并可調(diào)節(jié)類固醇激素受體、NF-κ B、p53 及RAG1/2 重組酶的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可由壞死細胞（而非凋亡細胞）被動釋放，或由受刺激的免疫細胞（包括單核/巨噬細胞、DC等

3、）主動分泌至胞外。胞外HMGB1可通過其B 盒與相應(yīng)受體(RAGE、TLR2、TLR4)結(jié)合，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)：①直接介導(dǎo)非特異性炎癥反應(yīng)（包括早期和晚期炎癥反應(yīng)）；②作為一種警報素，激活DC，從而啟動、增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與炎癥性疾病如膿毒血癥、急性肺損傷、某些自身免疫病如（系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎）、同種移植排斥反應(yīng)及多種病理過程發(fā)生和發(fā)展。
　　 國內(nèi)有文獻報道，HMGB1 參與D-GalN/LPS誘導(dǎo)的肝損

4、傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，注射Con A后1 h，實驗動物體內(nèi)HMGB1 mRNA表達即增加。但HMGB1 參與Con A所致肝損傷的確切作用及其機制，國內(nèi)外均尚未見文獻報道。
　　 本課題建立Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型，探討HMGB1 參與免疫性肝損傷的作用及其機制；在此基礎(chǔ)上，制備抗HMGB1 多克隆抗體和HMGB1特異性拮抗物HMGB1-A box 重組蛋白，觀察其對免疫性肝損傷的保護作用，并初步探討其機制，為設(shè)計干預(yù)病

5、毒性肝炎和自身免疫性肝炎的策略提供新思路。
　　 一、HMGB1 參與Con A所致急性肝損傷
　　 尾靜脈注射建立Con A誘導(dǎo)的肝損傷模型，設(shè)立PBS對照組。
　　 1.Con A 注射后不同時間點HMGB1 mRNA表達Con A 注射后2 h、6 h、12 h、24 h 取小鼠肝臟組織，提取總RNA，RT-PCR檢測HMGB1 mRNA表達水平。結(jié)果顯示：與對照組比較，Con A 處理后2 h，HMGB1

6、表達即上調(diào)，持續(xù)至24 h，尤以2 h 為明顯。
　　 2.肝組織HMGB1表達Con A 注射后12 h 取小鼠肝臟，免疫組織化學(xué)分析肝組織HMGB1表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常肝組織中，肝細胞和Kupffer細胞胞核內(nèi)僅低表達HMGB1；急性肝損傷組Kupffer細胞和肝實質(zhì)細胞胞核內(nèi)HMGB1 呈陽性表達，肝實質(zhì)細胞壞死區(qū)內(nèi)呈強陽性表達。
　　 3.外源性HMGB1可加重Con A所致肝損傷與單純Con A(10μg/g，

7、I.t.)組比較，非致死劑量的重組HMGB1（20μg/mouse，I.t.）和相同劑量Con A 同時注射，其ALT 值明顯升高，而小劑量重組HMGB1（20μg/mouse）未引起小鼠ALT 升高。
　　 以上結(jié)果提示：HMGB1 參與Con A誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)生。
　　 二、HMGB1特異性拮抗物的制備、純化和功能鑒定
　　 1.重組HMGB1免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，并借助蛋白G柱純化。
　　

8、 2.用本室黃亞非博士構(gòu)建的PGEX-4T-2-A box 原核表達載體，原核表達獲得大量GST-A box 融合蛋白；借助親和純化及去內(nèi)毒素處理。
　　 3.生物學(xué)實驗證實，抗HMGB1 多克隆抗體和重組r-A box可有效拮抗HMGB1的生物學(xué)功能。
　　 三、HMGB1特異性拮抗物對Con A所致急性肝損傷的保護作用及機制
　　 1.抗HMGB1 多克隆抗體對肝損傷小鼠的影響與IgG對照組比較，抗HMGB

9、1 多克隆抗體處理（0.6mg/mouse，30 min 前給藥）能顯著降低Con A所致肝損傷，表現(xiàn)為：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）明顯降低；HE 染色顯示肝細胞水腫變性壞死和炎性浸潤均明顯較輕。
　　 2.延遲給藥對小鼠血清ALT 水平的影響相同劑量Con A（15μg/g）注射2 h后，再給予抗HMGB1 多克隆抗體（0.6mg/mouse）處理小鼠，檢測Con A 注射12 h后小鼠血清ALT 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗HMGB1

10、多克隆抗體能明顯降低肝損傷小鼠血清ALT 水平。
　　 3.抗HMGB1 多克隆抗體對肝損傷小鼠生存的影響抗HMGB1 抗體預(yù)處理小鼠，然后尾靜脈注射完全致死劑量Con A（25μg/g），觀察抗HMGB1 抗體對小鼠生存的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與PBS與IgG組比較，抗HMGB1多克隆抗體處理不僅能提高小鼠生存率，并能延長小鼠存活時間。
　　 4.R-A box對肝損傷小鼠血清ALT 水平的影響與對照組比較，r-A box

11、處理（0.6mg/mouse，30 min 前給藥）能顯著降低Con A所致肝損傷小鼠血清ALT 水平。
　　 5.抗HMGB1 抗體對炎性細胞因子（TNF-α、IFN-γ）水平的影響Con A 注射后，小鼠血清TNF-α、IFN-γ含量明顯增高；抗HMGB1 抗體處理能顯著降低TNF-α、IFN-γ含量；體外實驗證實，抗HMGB1 能抑制Con A誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌TNF-α的作用。
　　 6.抗HMGB1

12、抗體對NF-κ B活性的影響注射Con A 3 h后，提取肝組織細胞核蛋白，凝膠遷移率實驗（EMSA）檢測NF-κ B活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：急性肝損傷時，胞漿NF-κ B 被激活并向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。經(jīng)抗HMGB1多克隆抗體預(yù)處理的小鼠，其肝組織細胞核內(nèi)NF-κ B活性水平顯著低于IgG對照組。
　　 7.抗HMGB1 抗體對肝細胞凋亡的影響注射Con A 12 h后，切取肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，TUNEL法檢測肝臟細胞凋

13、亡。結(jié)果顯示：Con A 處理后，肝細胞凋亡增加，而經(jīng)抗HMGB1 抗體預(yù)處理的小鼠其細胞凋亡明顯低于對照組。
　　 8.抗HMGB1 抗體對肝臟單個核細胞T、NKT細胞亞群的影響注射Con A后0 h、6 h、12 h，分別取各處理組小鼠肝臟，分離肝臟MNC，雙色標記檢測T、NKT細胞亞群。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗HMGB1 抗體組與IgG對照組間T、NKT 亞群無顯著差異。
　　 9.抗HMGB1 抗體對肝臟單個核細胞T、NKT

14、細胞活化的影響注射Con A 12 h后，取小鼠肝臟，分離肝臟MNC，以CD69 為標記檢測T、NKT細胞活化狀態(tài)。
　　 結(jié)果顯示：
　　 (1)抗HMGB1 抗體處理組的CD69+T細胞占T細胞比例明顯低于IgG對照組。
　　 (2)抗HMGB1 抗體處理組的CD69+NKT細胞占NKT細胞比例明顯低于IgG對照組。
　　 10.Con A誘導(dǎo)的肝損傷與TLR4（HMGB1 受體）相關(guān)Con A 處理

15、后6 h、12 h、24 h，可見TLR4表達，尤其以6 h 為明顯。注射相同劑量Con A，12 h 處死動物，取血清檢測ALT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：TLR4基因缺陷型小鼠（C3H/Hej）ALT 水平明顯低于TLR4 野生型小鼠（C3H/HeOuj）。
　　 四、HO-1 通過抑制HMGB1表達減輕LPS所致肺損傷HO-1誘導(dǎo)劑CoPP Ⅸ能顯著增加肺組織HO-1活性，進而保護LPS所致急性肺損傷，表現(xiàn)為：肺組織中炎性細胞（尤其是中性

16、粒細胞）浸潤減少，肺W/D、肺組織EBA含量降低及肺組織損傷減輕等。其機制可能涉及HO-1 上調(diào)可抑制TNF-ａ和HMGB1表達。
　　 五、結(jié)論：
　　 1. HMGB1 參與Con A所致急性肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。
　　 2. HMGB1特異性拮抗物能減輕Con A所致肝損傷，其機制可能為：抑制炎性因子釋放；抑制NF-κ B活性；抑制肝細胞凋亡；抑制T細胞、NKT細胞活化等。
　　 3. HO-1誘導(dǎo)劑