中國(guó)野生葡萄抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化初探.pdf

1、白粉病是危害葡萄生產(chǎn)的主要真菌病害之一。本課題組對(duì)葡萄白粉病進(jìn)行了長(zhǎng)期、系統(tǒng)的研究，對(duì)于該病的發(fā)病機(jī)理、鑒定方法、遺傳特性以及通過(guò)分子生物學(xué)手段進(jìn)行基因定位、克隆、蛋白質(zhì)融合表達(dá)等方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的進(jìn)展。 中國(guó)葡萄屬野生種及其雜種對(duì)于多種真菌病害具有很強(qiáng)的抗性，是優(yōu)良的抗病育種種質(zhì)資源。植物抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)是發(fā)現(xiàn)和研究較早，且其酶學(xué)特性、分布、定位、作用機(jī)理、生理功能和分子生物學(xué)特性比較清楚的重要酶類

2、。本實(shí)驗(yàn)所用基因APX是從中國(guó)葡萄屬野生種華東葡萄株系高抗白粉病的白河-35-1中經(jīng)mRNA差顯和RACE擴(kuò)增技術(shù)獲得的與抗白粉病相關(guān)基因。氨基酸序列同源性分析表明，中國(guó)葡萄屬野生種APX與其它植物的同源性介于79％-88％之間。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)基因克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-APX,后經(jīng)酶切、重組將目的基因APX與表達(dá)載體pWR306定向連接并構(gòu)建植物表達(dá)載體pWR-APX,凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌株GV3101制備成工程菌，然后探

3、索了無(wú)核葡萄皇家秋天葉片再生方法，最后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化葡萄葉片，對(duì)該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)得出了以下結(jié)果： 1.以華東葡萄白河-35-1的cDNA第一鏈為模板，以已克隆的中國(guó)葡萄屬野生種抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)基因序列設(shè)計(jì)特異引物PCR擴(kuò)增出目的片段，回收、酶切并與克隆載體pGEM-Teasy連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆。重組質(zhì)粒pGEM-T-APX酶切鑒定后，送公司測(cè)序，結(jié)果表明該序列為769

4、bp，為一完整的閱讀框架，編碼250個(gè)氨基酸。 2.雙酶切克隆載體pGEM-T-APX和表達(dá)載體pWR306，回收目的基因，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pWR-APX。經(jīng)酶切鑒定目的片段已定向連接到了表達(dá)載體pWR306中。 3.采用凍融法將重組表達(dá)質(zhì)粒pWR-APX導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，卡那霉素和慶大霉素篩選陽(yáng)性克隆，PCR檢測(cè)表明重組質(zhì)粒已導(dǎo)入GV3101中，制備了工程菌。 4.在重組質(zhì)