鏈霉菌3-10抗真菌代謝產(chǎn)物鑒定及防病潛力評估.pdf

1、鏈霉菌是一類絲狀原核生物，產(chǎn)孢，基因組G+C mol％含量在80％左右。鏈霉菌廣泛存在于土壤，海洋，植物組織內(nèi)以及空氣中。來源于鏈霉菌的天然活性次級代謝產(chǎn)物中占已知天然活性產(chǎn)物的70％～80％，包括殺蟲、除草、抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、酶類等生物活性的物質(zhì)。本研究以本實驗室分離到的鏈霉菌3-10作為研究對象，對其分類地位、生物活性、抗真菌物質(zhì)的分離純化與鑒定、揮發(fā)性物質(zhì)的生防潛力進行系統(tǒng)研究，主要結(jié)果如下:
　　1.確定了鏈霉菌3-

2、10的分類地位。從培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)、生理生化特征和分子鑒定對菌株3-10進行了鑒定。證明該菌株屬于陽陵鏈霉菌（Streptomycesyanglinensis）的一個新的進化型(Phylotype)。
　　2.確定了提取鏈霉菌3-10抗真菌物質(zhì)的有機溶劑劑及提取程序。發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯是最佳的提取有機溶劑。通過菌絲生長抑制法確定了鏈霉菌3-10粗提物的抑菌譜。結(jié)果表明:粗提物濃度為5μg/mL時對供試的16種植物病原真菌的抑制率大于8

3、0％。粗提物可以抑制灰葡萄孢的分生孢子萌發(fā)，以及根霉和毛霉的孢囊孢子萌發(fā)和芽管伸長。在草莓果實貯藏期，粗提物可以抑制灰葡萄孢、核盤菌、根霉、毛霉在果實上的侵染，顯著降低草莓腐爛嚴重程度。在保護地種植的草莓上，施用50μg/mL的粗提物可以降低草莓灰霉病的病情嚴重程度，田間試驗防效在50％左右，試驗過程中未發(fā)現(xiàn)粗提物對草莓生長有任何不良影響。粗提物對大麥白粉病可以起到保護作用兼具治療作用。
　　3.明確了鏈霉菌3-10粗提物抗真菌活

4、性的影響因子。結(jié)果表明，80℃處理10 min可以使粗提物的生物活性顯著下降。當粗提物經(jīng)紫外線(UV-C)下照射1min后其生物活性就開始下降，照射20 min后粗提物的生物活性完全喪失。在酸性條件下粗提物的水溶液呈懸濁液狀態(tài)，具有較高的生物活性。在堿性條件下粗提物水溶液呈澄清狀態(tài)，其生物活性有所下降。將粗提物制備成干粉后，粗提物的抗真菌活性在低溫至常溫條件下能保持較長時間。
　　4.從鏈霉菌3-10的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出2個抗真

5、菌化合物，即ReveromycinA和ReveromycinB。這兩個化合物均為白色無定型粉末，易溶于甲醇，不溶于水。這兩個化合物對4種植物病原真菌都能表現(xiàn)良好的抑菌作用。在相同環(huán)境pH值條件下，Reveromycin A的抗真菌活性高于Reveromycin B。在pH=4.5條件下，Reveromycin A對灰葡萄孢、核盤菌、根霉、毛霉菌絲生長的EC50分別為0.88μg/mL、0.65μg/mL、0.67μg/mL和0.73μg

6、/mL;對灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的EC50為0.57μg/mL;對根霉、毛霉孢囊孢子萌發(fā)EC50分別為0.10μg/mL和0.11μg/mL;Reveromycin B對灰葡萄孢、核盤菌、根霉、毛霉菌絲生長的EC50分別為5.37μg/mL、5.49μg/mL、4.48μg/mL和4.07μg/mL;對灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的EC50為4.01μg/mL;對根霉、毛霉孢囊孢子萌發(fā)EC50為1.15μg/mL和1.59μg/mL。Revero

7、mycinA和ReveromycinB的抗真菌活性隨著環(huán)境pH值的升高而下降。
　　5.明確了鏈霉菌3-10產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)(VOCs)的化學成分及抗真菌活性。通過GC-MS檢測及數(shù)據(jù)庫比對，確定了不同培養(yǎng)時間的鏈霉菌3-10產(chǎn)生的VOCs種類及含量。共檢測到19種VOCs，包括脂肪醇類、芳香族醇類、萜類、有機酸酯類和烯烴類。其中，2-甲基異莰醇是鏈霉菌3-10產(chǎn)生的VOCs的主要成分。在10d菌齡培養(yǎng)物中，2-甲基異莰醇的相對含

8、量占27.9％。從中選擇了4種VOCs，即2-甲基異莰醇、2-甲基丁酸甲基酯、苯乙醇和石竹烯，測定了這些物質(zhì)的純品對黃曲霉和寄生曲霉菌絲生長和產(chǎn)孢抑制活性。結(jié)果表明:2-甲基異莰醇、2-甲基丁酸甲基酯和苯乙醇均可以顯著抑制黃曲霉和寄生曲霉的菌絲生長和產(chǎn)孢，石竹烯幾乎沒有抗真菌活性。同時，2-甲基丁酸甲基酯對黃曲霉和寄生曲霉分生孢子萌發(fā)表現(xiàn)出較好的抑制作用。
　　6.明確了鏈霉菌3-10產(chǎn)生的VOCs對花生貯藏期黃曲霉和寄生曲霉污染

9、以及產(chǎn)黃曲霉毒素的抑制效果。當鏈霉菌3-10小麥粒培養(yǎng)物為17 g/L時，所釋放的VOCs熏蒸花生籽粒7d后，顯著抑制黃曲霉和寄生曲霉分對花生籽粒的侵染。當熏蒸源濃度上升至86g/L時，可以基本抑制黃曲霉和寄生曲霉對花生籽粒的侵染，在籽粒中也沒有檢測到黃曲霉毒素的產(chǎn)生。通過掃描電鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過鏈霉菌3-10產(chǎn)生的VOCs熏蒸后，黃曲霉和寄生曲霉菌絲變得畸形，塌陷。經(jīng)高濃度VOCs熏蒸后，黃曲霉和寄生曲霉分生孢子不能萌發(fā)。以上結(jié)果表明

10、，鏈霉菌3-10產(chǎn)生的VOCs具有生防潛力。
　　7.獲得了鏈霉菌3-10全基因組信息。全基因組大小為8.65 Mb，染色體大小為8.59 Mb，質(zhì)粒大小為55.49 Kb，基因組G+C mol％含量為73.8％。在全基因組中預測到了7051個編碼基因。通過antismash在線比對發(fā)現(xiàn)了34個次級代謝產(chǎn)物合成基因簇。其中，合成reveromycins的基因簇與Streptomyces reveromyceticusSN-593的