幾種主要海洋經(jīng)濟(jì)簾蛤種質(zhì)鑒定及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)文蛤(Meretrix meretrix L．1758)、青蛤(Cyclina sinensis G，1791)、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria L.，1758)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum A.，1850)的4種組織(肝、鰓、后閉殼肌和外套膜)的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同簾

2、蛤的同工酶譜有明顯的差異；同種簾蛤不同組織間的EST和MDH同工酶有一定的組織特異性；EST和MDH同工酶位點(diǎn)豐富，可用于不同物種的鑒定；肝、鰓EST和閉殼肌MDH酶活性較高，是進(jìn)行同工酶分析的理想材料。 對(duì)硬殼蛤5種組織(足、外套膜、閉殼肌、鰓和肝)的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)同工酶進(jìn)行了比較研究，并對(duì)酶譜表型及位點(diǎn)表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，硬殼蛤上述組織的EST和MDH同工酶存在不同程度的組

3、織特異性，而LDH沒(méi)有組織特異性。在EST酶譜中，肝組織染色最深，說(shuō)明其EST活性最高，這與肝臟是重要的消化腺和解毒器官相適應(yīng)。在MDH酶譜中發(fā)現(xiàn)了s．MDH和m-MDH所形成的譜帶，閉殼肌的MDH譜帶染色很深，這與肌肉需要由三羧酸循環(huán)提供大量ATP相適應(yīng)。 2.4種簾蛤群體遺傳多樣性和種間關(guān)系及文蛤4個(gè)地理種群遺傳結(jié)構(gòu)的 fhFLP分析 利用熒光標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(fAFLP)技術(shù)對(duì)4種簾蛤(文蛤、青蛤、菲律賓蛤

4、仔和硬殼蛤)的群體遺傳多樣性和種間關(guān)系進(jìn)行了研究。選擇EcoR I／Mse I進(jìn)行酶切，使用6個(gè)E+3／M+3引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得1096個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率95.1％，片段長(zhǎng)度50-456bp。其中，文蛤、青蛤、菲律賓蛤仔和硬殼蛤分別得到681、715、702和694個(gè)位點(diǎn)，各物種相應(yīng)的多態(tài)位點(diǎn)比率為76.8％、81.7％、83.0％和75.1％，得到17個(gè)物種特異性位點(diǎn)，可作為4物種特征標(biāo)記。分析了群體遺傳相似系數(shù)和遺傳多樣性指

5、數(shù)以及種間遺傳相似系數(shù)。結(jié)果表明，硬殼蛤群體遺傳相似系數(shù)最高(0.6709)，遺傳多樣性指數(shù)最低(0.2360)；菲律賓蛤仔群體遺傳相似系數(shù)最低(0.5925)，遺傳多樣性指數(shù)最高(0.2618)。根據(jù)遺傳相似系數(shù)采用UPGMA法構(gòu)建了4物種的聚類圖，表明文蛤與菲律賓蛤仔遺傳關(guān)系最近，青蛤與其他3物種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。使用3個(gè)E+3／M+3引物組合，對(duì)連云港、大連、湛江和防城港4個(gè)地理種群文蛤的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，共檢測(cè)到329個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)

6、位點(diǎn)比率分別為76.7％、74.5％、73.5％和75.2％；種群內(nèi)遺傳相似系數(shù)分別為0.6193、0.6331、0.6577和0.6411，遺傳多樣性指數(shù)分別為0.2428、0.2347、0.2216和0.2232，以連云港文蛤多態(tài)位點(diǎn)比率和遺傳多樣性指數(shù)最高，種群內(nèi)遺傳相似系數(shù)最低，表明連云港文蛤具有更豐富的遺傳多樣性水平，但4個(gè)種群間差異不大。連云港、大連和湛江文蛤種群間遺傳相似系數(shù)與各自種群內(nèi)的遺傳相似系數(shù)沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明3種

7、群遺傳分化不明顯，推測(cè)造成這一現(xiàn)象的原因是：大連和湛江近期發(fā)生過(guò)從連云港或江蘇引種事件，從而引起3種群的基因交流，但還需要進(jìn)一步的證據(jù)。聚類分析表明，防城港種群與其他3種群首先分開(kāi)，表現(xiàn)出一定的遺傳分化?？偟膩?lái)說(shuō)，我國(guó)不同地區(qū)的文蛤遺傳多樣性水平較高，遺傳改良潛力仍然很大。 3．簾蛤科貝類rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及5.8S rRNA基因序列研究 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增了文蛤、青蛤、硬殼蛤、江戶布目蛤(Prototh

8、acajedoensis L.，1874)、薄片鏡蛤(Dosinia corrugata R.，1850)和菲律賓蛤仔6種簾蛤的第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS2)序列，并進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果表明，6種簾蛤ITS1序列長(zhǎng)度522-900bp，是迄今已報(bào)道雙殼貝類中變化范圍最大的，GC含量57.66％-65.62％；ITS2序列長(zhǎng)度281-412bp，GC含量65.21％-67.87％。6種簾蛤ITS1和ITS2序列種間

9、差異很大，有明顯的長(zhǎng)度多態(tài)性，ITS2種間序列相似度高于ITS1。通過(guò)對(duì)ITS1和ITS2序列的組裝獲得了6種簾蛤5.8S rRNA基因完整序列，序列全長(zhǎng)均為157bp。以ITS2序列(包含5.8S和28S rRNA基因部分序列)為標(biāo)記，用北極蛤科的Arctica islandica相應(yīng)序列數(shù)據(jù)作外群，構(gòu)建了簾蛤科貝類的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示同屬雪蛤亞科的江戶布目蛤與硬殼蛤親緣關(guān)系最近。 采用ITS序列對(duì)文蛤種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行

10、了研究，文蛤4個(gè)地理種群8個(gè)測(cè)序個(gè)體共發(fā)現(xiàn)5個(gè)ITS1單倍型，ITS1序列5’端存在串聯(lián)重復(fù)和微衛(wèi)星序列，它在不同群體中的重復(fù)次數(shù)不同，從而造成ITS1序列長(zhǎng)度變化很大，種群間序列差異度最大達(dá)3.6％，由于文蛤ITS1中存在串聯(lián)重復(fù)序列，且ITS1長(zhǎng)度較大不利于測(cè)序，限制了其在種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用。相比較，ITS2序列長(zhǎng)度適中且變化很小，適合進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，4個(gè)地理種群48個(gè)測(cè)序樣品共發(fā)現(xiàn)15個(gè)ITS2單倍型，聚類分析表明，連

11、云港、大連和湛江種群的單倍型間沒(méi)有形成單獨(dú)的分枝，存在交叉，而防城港種群雖未單獨(dú)聚為一枝，但與其他3種群分開(kāi)，這與fAFLP分析的結(jié)果是一致的。4.6種簾蛤和4個(gè)地理種群文蛤線粒體COI基因片段序列分析對(duì)文蛤、青蛤、硬殼蛤、江戶布目蛤、薄片鏡蛤和菲律賓蛤仔6種簾蛤和4個(gè)地理種群文蛤(大連、連云港、湛江和防城港)的細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(COI)基因片段序列進(jìn)行了分析，以探討這一序列在種質(zhì)鑒定、種群遺傳結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用價(jià)值。

12、測(cè)序結(jié)果表明，所有物種擴(kuò)增片段長(zhǎng)度均為709bp，序列A+T含量(62.2％-67.6％)明顯高于GC含量。物種間共有變異位點(diǎn)311個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)202個(gè)，全部為轉(zhuǎn)換或顛換，堿基的替換位置主要發(fā)生在密碼子的第三位；種間堿基差異度較大為20.2％-32.6％，因此，支持簾蛤科設(shè)亞科分類階元的觀點(diǎn)；此區(qū)段共編碼235個(gè)氨基酸，種間共有氨基酸變異位點(diǎn)85個(gè)。以COI基因片段序列為標(biāo)記，用竹蟶科的大竹蟶相應(yīng)序列數(shù)據(jù)作外群，構(gòu)建了簾蛤科貝類

13、的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示4個(gè)地理種群文蛤首先聚為1個(gè)單元，然后與青蛤聚在一起，最后所有簾蛤科物種聚為一枝，與外群相區(qū)別?；贑OI序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)分類與一定差別，硬殼蛤沒(méi)有與同一亞科的江戶布目蛤聚在一起，而是首先與鏡蛤亞科的薄片鏡蛤聚為一枝，這與基于ITS2分析的結(jié)果不同。采用COI序列對(duì)文蛤種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。文蛤4個(gè)地理種群40個(gè)測(cè)序個(gè)體共發(fā)現(xiàn)15個(gè)COI單倍型，其中連云港WL2與大連WD1兩個(gè)單倍型序列相同，為共

14、享單倍型。種群間有51個(gè)變異位點(diǎn)，其中，轉(zhuǎn)換50處，顛換1處。堿基替換主要出現(xiàn)在防城港種群與其他種群之間，種群內(nèi)變異位點(diǎn)較少。不同單倍型之間序列差異百分比0.0-7.1％，防城港種群與其他種群間差異較大，大連、連云港及湛江3個(gè)種群間差異較小。在51個(gè)變異位點(diǎn)中，10個(gè)發(fā)生在密碼子的第一位，41個(gè)發(fā)生在密碼子的第三位，但由于密碼子的兼并性，發(fā)生在密碼子第三位的變異全部不引起編碼氨基酸的改變(同義突變)，而發(fā)生在密碼子第一位的變異，只有1處