基因工程Th17細胞的研制及其功能的探討.pdf

1、目的:通過慢病毒介導(dǎo)小鼠CD4+CD25-na(?)ve T細胞過表達RORγt基因，同時結(jié)合TGF-β和1L-6，探索和優(yōu)化制備高純度Th17細胞的方法，并評價其是否具有類似天然Th17細胞的功能。
　　 方法:1．小鼠RORγt基因的克隆及重組慢病毒載體pXZ9-RORγt的構(gòu)建：Trizol法提取C57BL/6小鼠胸腺總RNA，經(jīng)MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得小鼠胸腺cDNA;以小鼠胸腺cDNA為模板，使用PCR技術(shù)擴增小鼠RO

2、Rγt基因片段，并將其克隆至載體PCR2.1，酶切及測序鑒定；酶切獲得純化的RORγt基因片段，亞克隆入載體MigR1，酶切回收純化的RORγt-IRES-GFP片段，連接入慢病毒載體pTK208，酶切鑒定正確陽性克隆，命名為pXZ9-RORγt。2．重組慢病毒顆粒的包裝及RORγt基因在293FT細胞中的表達：使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞系293FT包裝細胞，分別于轉(zhuǎn)染后48h、72h收集慢病毒上清，超速離心

3、濃縮慢病毒顆粒，有限稀釋法測定病毒滴度，-80℃保存?zhèn)溆?。使用重組慢病毒顆粒pXZ9-RORγt感染293FT細胞，熒光顯微鏡觀察EGFP蛋白的表達，Western-blot鑒定小鼠RORγt蛋白的表達。3．重組慢病毒感染淋巴細胞的條件優(yōu)化：淋巴細胞分離液分離小鼠脾臟單個核細胞，免疫磁珠分選獲得小鼠CD4+CD25-T淋巴細胞，設(shè)立四個實驗組（各設(shè)三個復(fù)孔）行原代淋巴細胞的感染條件摸索，分別為：ConA組(培養(yǎng)基中加入ConA使終濃度5

4、μg/mL);CD3組（細胞接種于提前使用濃度為5μg/mL的抗小鼠CD3ε抗體包被的24孔板）；CD3+CD28組（細胞接種于CD3ε抗體預(yù)處理的24孔板，加入抗小鼠CD28單抗使終濃度為1μg/mL）；CD3+CD28+1L-2組（在CD3ε抗體、CD28抗體存在的條件下，加入IL-2至終濃度為10μg/mL）；空白對照組（將CD4+CD25-na(?)veT細胞接種于含10％FBS的1640培養(yǎng)基中）。37℃、5％CO2濃度下培養(yǎng)

5、。待細胞培養(yǎng)至36h，加入濃縮的慢病毒顆粒使MOI=3，并加入聚凝胺促進病毒吸附，2000r/min離心2h后常規(guī)培養(yǎng)。取感染后72h細胞，熒光顯微鏡觀察GFP陽性細胞率。綜合評價后選感染效率最高的培養(yǎng)方法應(yīng)用于下游實驗。4．工程Th17細胞的制備及功能鑒定：將CD3+CD28+IL-2共同刺激培養(yǎng)36h的CD4+CD25-na(?)ve T細胞分別分為4個實驗組（各設(shè)三個復(fù)孔），分別為：pXZ9-RORγt組（單純使用重組慢病毒顆粒p

6、XZ9-RORγt感染后細胞）；TGF-β+IL-6組（pXZ9慢病毒顆粒感染后細胞加入TGF-β和IL-6培養(yǎng)）；聯(lián)合組（pXZ9-RORγt慢病毒顆粒感染后細胞于含TGF-β和IL-6的培養(yǎng)基中培養(yǎng)）；空載體對照組（單純pXZ9慢病毒顆粒感染后細胞）；各組細胞培養(yǎng)3天后，流式細胞術(shù)分選GFP陽性細胞，鑒定各實驗組IL-17+IFN-γ-細胞比例，熒光定量PCR技術(shù)鑒定各組細胞IL-17A，IL-17F，IL-21，IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平

7、。使用弗氏完全佐劑溶解MOG多肽聯(lián)合百日咳毒素，免疫C57/BL6小鼠，建立小鼠實驗變應(yīng)性腦炎(EAE)模型，同時尾靜脈注射各實驗組細胞，每日觀察小鼠狀態(tài)并進行臨床評分，評估基因工程Th17細胞是否具有加重EAE的功能。
　　 結(jié)果:1．經(jīng)酶切鑒定及測序結(jié)果證實，成功構(gòu)建pXZ9-RORγt重組慢病毒載體，脂質(zhì)體包裝的重組慢病毒顆粒經(jīng)超速離心濃縮后濃度達108IU/mL;濃縮的病毒顆粒pXZ9-RORγt感染293FT細胞后成功

8、檢測到RORγt蛋白。2．經(jīng)免疫磁珠分選后，CD4+CD25-淋巴細胞陽性率可達95％以上。行淋巴細胞感染條件探索，熒光顯微鏡觀察各實驗組GFP陽性細胞率，見CD3+CD28+IL-2組GFP陽性率最高，約為(8.24±1.53)％，與其他各組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。臺盼藍染色鑒定各實驗組細胞存活率，其中CD3+CD28+IL-2組細胞藍染率最低，約(7.75±1.63)％，較其他各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。3.

9、使用CD3+CD28+IL-2刺激培養(yǎng)的CD4+CD25-T淋巴細胞行基因工程Th17細胞的制備：pXZ9-RORγt組IL-17+IFN-γ-細胞比例占(40.25±5.46)％，TGF-β+IL-6組IL-17+IFN--細胞占（14.36±5.27）％，聯(lián)合組IL-17+IFN-γ-細胞比例達(60.59±8.15)％，明顯高于其他各組(p＜0.05)，單純空載體組轉(zhuǎn)導(dǎo)不能啟動Th17細胞發(fā)育。4．熒光定量PCR法檢測各組細胞IL

10、-17A、1L-17F、IL-21、IFN-γ基因表達水平，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，聯(lián)合組、pXZ9-RORγt組、TGF-β+IL-6組IL-17A、IL-17F表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，其中聯(lián)合組升高幅度最大，與pXZ9-RORγt組、TGF-β+IL-6組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，與而空載體組IL-17A，IL-17F表達水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；聯(lián)合組、TGF-β+IL-6組IL-

11、21表達水平較空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，空載體組、pXZ9-RORγt組與空白對照組相比1L-21表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；與空白對照組相比，僅空載體組IFN-γ表達水平略有升高，而聯(lián)合組、pXZ9-RORγt組、TGF-β+IL-6組均較低。5．常規(guī)建立小鼠EAE模型，給予尾靜脈注射各實驗組細胞，與空白對照組相比，加注pXZ9-RORγt組、TGF-β+IL-6組及聯(lián)合組細胞后小鼠EAE臨床