血管平滑肌線粒體損害在重癥休克血管低反應(yīng)性發(fā)生中的作用.pdf

1、重癥休克時(shí)血管反應(yīng)性低下,微血管對(duì)升壓藥物不起反應(yīng),帶來血壓持續(xù)下降和重要臟器灌流不足,它是晚期休克難以治療和休克死亡的重要因?yàn)橹?。本室前期工作查?休克時(shí) ATP 生成減少,導(dǎo)致細(xì)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(arteriolarsmooth muscle cells,ASMCs)ATP敏感鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)大量開放和細(xì)胞膜超極化,是血管平滑肌低反應(yīng)性重要機(jī)制之一。但是重癥創(chuàng)傷失血性

2、休克晚期,經(jīng)過輸血、補(bǔ)液、升壓藥物等抗休克治療以后,血壓仍難以回升,為什么給了氧氣和養(yǎng)料以后,血管平滑肌仍然對(duì)升壓物質(zhì)不起反應(yīng)。它提示重癥休克ASMCs內(nèi)ATP的減少,不僅來自氧氣和養(yǎng)料供應(yīng)不足,還可能由于線粒體本身發(fā)生損傷,線粒體功能不全(mitochondrial dysfunction)使ATP合成減少。如果線粒體確實(shí)發(fā)生了損傷,保護(hù)血管平滑肌線粒體則成為防治休克低血壓新的靶點(diǎn)和思路,但至今尚未見報(bào)道。為此,本實(shí)驗(yàn)利用大鼠失血性休

3、克模型,采用透射電鏡、熒光探針技術(shù)、生物化學(xué)發(fā)光和膜片鉗等技術(shù),分別從線粒體、平滑肌細(xì)胞、血管反應(yīng)性和整體抗休克四個(gè)不同水平研究了研究重癥失血性休克平滑肌細(xì)胞線粒體的改變及其與血管平滑肌反應(yīng)性下降的關(guān)系。
　　 第一部分重癥休克血管平滑肌細(xì)胞線粒體的改變
　　 一、血管平滑肌細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變:分離重癥失血性休克給予一般抗休克治療60min(單純休克組)時(shí)ASMCs,以及相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組、休克+環(huán)孢霉素A組、休克

4、+蒼術(shù)苷+環(huán)孢霉素A組ASMCs。用透射電鏡觀察到假手術(shù)組大鼠血管平滑肌線粒體包膜完整,嵴致密、連續(xù),基質(zhì)清楚；單純休克組線粒體腫脹,嵴排列紊亂,甚至斷裂,形成電子透亮區(qū),基質(zhì)成斑點(diǎn)狀,甚至空泡狀；休克前給予線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔抑制劑環(huán)孢霉素A(CsA)預(yù)處理,此組線粒體有一定的水腫,但結(jié)構(gòu)較完整,嵴較致密,排列較整齊,少部分?jǐn)嗔?；線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放劑蒼術(shù)苷(ATR)可抑制環(huán)孢霉素A線粒體保護(hù)作用。結(jié)果提示重癥休克后,血管平滑肌線粒體

5、結(jié)構(gòu)受損,且與線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放有關(guān),抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變可以保護(hù)線粒體。
　　 二、血管平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的改變:用流式細(xì)胞儀檢測陽離子熒光探針JC-1標(biāo)記的平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的改變。提示重癥休克此期線粒體通透性轉(zhuǎn)變?cè)黾?可能促進(jìn)線粒體膜電位去極化,促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙。
　　 三、血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平的改變:利用CellTiter-Glo(R)熒光素酶生物發(fā)光法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP相對(duì)含量。給予蒼術(shù)

6、苷預(yù)處理可以抑制環(huán)孢霉素A保護(hù)作用,平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低為假手術(shù)組的21.60±8.90％(與假手術(shù)組相比P=0.000；與單純休克組相比P=0.894)。以上提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護(hù)線粒體,可以增加重癥休克后細(xì)胞內(nèi)ATP含量。
　　 四、血管平滑肌細(xì)胞KATP通道的改變:用穿孔全細(xì)胞膜片鉗記錄法,在電壓鉗模式下,記錄并觀察KATP通道電流變化的情況,從KATP通道電流的Ⅰ-Ⅴ曲線可見,其反轉(zhuǎn)電位大約為-40mV,無

7、明顯整流特性。以上結(jié)果提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護(hù)線粒體,可以抑制KATP通道開放。
　　 五、血管平滑肌細(xì)胞膜電位的改變:同時(shí)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗術(shù)電流鉗模式,記錄單個(gè)細(xì)胞的靜息跨膜電位。單純休克組ASMCs靜息膜電位由假手術(shù)組(n=31cells)的-32.1±5.1mV增加到-48.5±8.2mV(P=0.000),提示重癥休克此期血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了超極化改變。環(huán)孢霉素A預(yù)處理組ASMCs靜息膜電位為-37.8±7.7mV

8、,與單純休克組差異顯著(P=0.011),其作用可被蒼術(shù)苷抑制,該組ASMCs靜息膜電位(-50.6±11.1mV)與單純休克組無顯著差異(P=0.972)。以上提示抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護(hù)線粒體,可抑制重癥休克后血管平滑肌細(xì)胞超極化。
　　 第二部分血管平滑肌線粒體損傷細(xì)胞模型的建立和對(duì)收縮反應(yīng)的影響
　　 為了確證線粒體損傷能引起平滑肌收縮反應(yīng)下降,用線粒體損傷劑(MPTP開放劑)ATR建立了體外平滑肌細(xì)胞線粒體損

9、傷模型,并進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):
　　 一、ATR對(duì)血管平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響:當(dāng)加入不同濃度ATR后,引起正常細(xì)胞和休克細(xì)胞線粒體膜電位降低的細(xì)胞百分率增加,即細(xì)胞線粒體去極化,且正常細(xì)胞和休克細(xì)胞之間有顯著差異(析因分析,F=204.676,P=0.000),休克細(xì)胞組(均數(shù)為48.52％)顯著高于正常細(xì)胞組(均數(shù)為23.13％)。ATR不同濃度作用之間有顯著差異(F=101.780,P=0.000)。在正常細(xì)胞組分別在AT

10、R作用10min和30min時(shí),隨加入ATR濃度增高,線粒體去極化越顯著,且兩兩比較均有顯著差異(F=37.907,P=0.000；F=41.501,P=0.000)。在休克細(xì)胞組分別在ATR作用10min和30min時(shí),隨其濃度增高線粒體去極化改變有顯著差異(F=29.093,P=0.000；F=22.468,P=0.000),5μM和7.5μMATR對(duì)線粒體去極化改變均無顯著差異(10min:P=0.858；30min:P=1.00

11、0)。用藥后不同時(shí)間之間無顯著差異(F=1.055,P=0.309)。以上結(jié)果提示ATR可能通過促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放,引起平滑肌細(xì)胞線粒體去極化,抑制線粒體作用甚至誘導(dǎo)線粒體損害,此作用具有一定濃度依賴性但無時(shí)間依賴性。
　　 二、ATR對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量和膜電位的影響:用生物化學(xué)發(fā)光法和激光共聚焦顯微鏡技術(shù),測定7.5μMATR體外作用于正常組和休克組血管平滑肌細(xì)胞10min對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量和膜電位的

12、影響。正常血管平滑肌細(xì)胞在ATR作用10min后,平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少,比ATR處理前減少25％,有顯著差異(t=3.389,P=0.01),但ATR對(duì)正常細(xì)胞膜電位無顯著影響,提示7.5μMATR對(duì)線粒體抑制可直接導(dǎo)致正常平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低,但此改變并未影響到細(xì)胞膜電位。ATR使休克血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量減少,為ATR處理前的59％,有顯著差異(t=3.904,P=0.005)。膜電位發(fā)生超極化,表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度減弱為

13、加藥前的72.74±4.19％(加藥前后比較用配對(duì)的t檢驗(yàn),t=14.550,P=0.000),提示此條件下休克平滑肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低,它可導(dǎo)致細(xì)胞膜電位發(fā)生超極化改變。作為對(duì)照,溶劑HPSS對(duì)正常和休克平滑肌細(xì)胞膜電位均無顯著影響。
　　 三、ATR對(duì)血管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)的影響:分別觀察了7.5μMATR體外對(duì)正常組和休克組離體血管平滑肌細(xì)胞對(duì)NE(正常組1μg/ml,休克組60μg/ml)的反應(yīng)性的影響。結(jié)果表明,正常

14、血管平滑肌細(xì)胞在ATR作用10min后,用NE刺激面積減少了37.83±5.74％,與未加ATR處理的正常細(xì)胞收縮百分率(44.10±3.30％)有顯著差異(t=2.318,P=0.043)。休克血管平滑肌細(xì)胞ATR作用10min后,用NE刺激面積減少了10.94±2.78％,與未加ATR處理的休克細(xì)胞收縮百分率(25.59±2.37％)有顯著差異(t=9.816,P=0.000)(見表5)。提示線粒體抑制可直接導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)減

15、弱,可能與細(xì)胞內(nèi)ATP水平減低有關(guān)。
　　 第三部分保護(hù)線粒體藥物-CsA在整體大鼠防治休克血管低反應(yīng)性和低血壓可能性
　　 為了進(jìn)一步查明線粒體在重癥休克后血管低反應(yīng)性發(fā)生中的作用,我們?cè)谡w試驗(yàn)觀察了線粒體靶向藥物對(duì)重癥休克時(shí)血管對(duì)去甲腎上腺素(NE)的反應(yīng)性和血壓影響。重癥休克失血120min后,回輸血液和給予升壓藥多巴胺(1mg/kg)后治療60min時(shí),血管對(duì)NE刺激產(chǎn)生收縮閾值仍增高,為失血前40.9倍,血壓

16、比失血120min時(shí)僅上升了11.7mmHg。同時(shí),在CsA預(yù)處理組,血管對(duì)NE刺激產(chǎn)生收縮閾值增加為失血前20.6倍,血壓比失血120min時(shí)上升了34.2mmHg。說明給予線粒體保護(hù)劑CsA,可降低血管對(duì)NE反應(yīng)閾值(P=0.000),并可顯著增加多巴胺的升壓作用(P=0.000)；CsA預(yù)處理前給予ATR,則可消除CsA的保護(hù)效應(yīng)。以上結(jié)果表明,抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變和保護(hù)線粒體有利于恢復(fù)休克血管反應(yīng)性和防止低血壓,為重癥休克頑固性

17、低血壓治療提出了一條新途徑。然而CsA可以使重癥休克動(dòng)物生存時(shí)間明顯延長的同時(shí),并不能顯著提高休克動(dòng)物的24小時(shí)存活率,CsA預(yù)處理組24h動(dòng)物存活率僅為3/8。說明休克低血管反應(yīng)的發(fā)生還有其它機(jī)制參與,同時(shí)CsA有免疫抑制等副作用,它并不是理想的抗休克藥物。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備線粒體損傷的細(xì)胞模型和重癥失血性休克大鼠模型,建立血管平滑肌線粒體損傷的系列測定方法,檢測它與血管收縮反應(yīng)的關(guān)系。
　　 2.