結(jié)核分枝桿菌毒力基因mce1a侵襲性機制研究及微生物16S rDNAs快速分類鑒定.pdf

1、近年，結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染所致結(jié)核病(TB)的發(fā)病率和死亡率一直高居不下。在全球，Mtb感染者幾占總?cè)丝诘娜种?，每年TB新發(fā)和死亡患者分別在900萬和200萬人左右。本研究立足于Mtb侵襲相關(guān)基因mce1a，首先，探討了該基因在Mtb潛伏生存與活性增殖狀態(tài)下的表達特性，并對其全長和截短序列分別進行了克隆、原核表達及純化。其次，設(shè)計、轉(zhuǎn)錄合成了兩條mce1a特異性小干擾RNAs(siRNAs)，并通過HEK293-T細胞，對si

2、RNAs的抑制活性與抑制效率進行了鑒定。在上述工作基礎(chǔ)上，進一步通過小鼠巨噬細胞RAW264.7和人結(jié)腸癌上皮細胞CT26.CL25，進行了T-Mce1A蛋白的細胞刺激實驗、mce1a特異性siRNA的體外干擾實驗以及重組E.coli(表達完整Mce1A蛋白)的體外侵襲實驗，著重探討了Mce1A蛋白介導(dǎo)細菌侵襲的作用機制。此外，本研究還通過對多種微生物16SrDNAs的序列比對與進化樹分析，分別設(shè)計、合成了細菌通用及特異性引物，建立了實

3、時熒光定量PCR(FQ-PCR)快速分類與檢測方法。 一、毒力基因mce1a在Mtb潛伏生存與活性增殖狀態(tài)下的表達特性Mtb屬專性需氧細胞內(nèi)寄生菌，感染后能在宿主體內(nèi)以休眠狀態(tài)長期潛伏生存，并在一定條件下復(fù)蘇、大量增殖從而引發(fā)疾病。鑒于Mtb在低于25℃時停止生長，故低溫條件下長時間存活的Mtb菌株可以作為一種非增殖狀態(tài)的體外模型。本研究選取兩種標(biāo)準(zhǔn)株(強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra)及八種臨床分離株(非耐藥四株，耐利福平或

4、異煙肼各兩株)，分別以4℃保存3m與37℃培養(yǎng)2w～5w為其潛伏生存和活性增殖狀態(tài)。通過溶菌酶、蛋白酶K及1％SDS裂解Mtb，提取、純化總RNA，并以不含RNase的DNase消化去除DNA。設(shè)計、合成mce1a特異性引物，以看家基因16SrRNA為平行參照，通過RT-PCR分別檢測上述樣品mce1a的表達。結(jié)果顯示，處于非增殖期的十種Mtb菌株，mce1a基因均未見表達；而處于活性增殖期的上述菌株，mce1a基因均有穩(wěn)定表達，且在不

5、同菌株的表達水平相似。上述結(jié)果初步提示，mce1a基因的表達可能與Mtb侵襲力或潛伏生存能力有關(guān)。 二、Mce1A蛋白介導(dǎo)細菌侵襲的作用機制首先，進行了全長與截短mce1a基因的克隆及原核表達。設(shè)計Exo-primer、In-primer及In-primer2共三對引物，通過巢式PCR，分別擴增Mtb(H37Rv)全長與截短的mce1a基因——mce1a和T-mce1a，并將其克隆至6×His原核表達載體pROEX-HTb和熱誘

6、導(dǎo)表達載體pBV220，分別通過IPTG或42℃加熱誘導(dǎo)目的基因的表達，并進行Ni-NTA柱純化或分子篩純化。對菌體樣品和純化樣品分別進行SDS-PAGE分析，并對pROEX-mce1a菌體樣品及純化產(chǎn)物，以抗6×HisMAb進行Westernblot鑒定。結(jié)果顯示，(i)對pROEX-mce1a和pBV-Tmce1a轉(zhuǎn)化菌，分別在約45KDa和27KDa處有目的蛋白條帶，與預(yù)期分子量基本一致；完整的Mce1A蛋白(含N端信號肽)以非可

7、溶性表達，且可能穩(wěn)固表達于細菌細胞壁或細胞膜；截短的T-Mce1A蛋白(為活性部分，不含N端信號肽)則主要以包涵體形式表達，部分(約1/3)以可溶性表達，側(cè)面反映了N端疏水性信號序列對Mce1A定位的影響。(ii)經(jīng)Ni-NTA柱純化或包涵體變性、復(fù)性及分子篩純化，均可獲得相應(yīng)分子量的目的蛋白，但Mce1A因其膜表達特性導(dǎo)致表達量及純化得率均較低，T-Mce1A則因表達量高(菌體總蛋白的20％)而有較高得率與純度。 其次，進行了

8、特異性siRNAs的設(shè)計、轉(zhuǎn)錄合成，以及在HEK293-T細胞內(nèi)靶向mce1a的干擾實驗。為便于檢測，將全長mce1a克隆至增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)基因的上游，構(gòu)建表達Mce1A-EGFP融合蛋白的真核質(zhì)粒pEGFPN1-mce1a。以在線軟件“siRNATargetFinder”及“BLAST”設(shè)計、篩選靶向mce1a的siRNAs模板，通過T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，合

9、成si312(特異性)、si410(特異性)、siEGFP(陽性對照)和siIRR(陰性對照)等siRNAs。應(yīng)用脂質(zhì)體，將pEGFPN1-mce1a質(zhì)?；蚍謩e與2.0μl各siRNAs(約1.5nmol/μl)共轉(zhuǎn)染HEK293-T細胞，通過熒光顯微鏡、半定量RT-PCR及Westernblot，對特異性siRNAs的抑制活性進行初步鑒定。進一步，將各siRNAs分多個劑量梯度共轉(zhuǎn)染，并通過熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)、FQ-PCR及Wes

10、ternblot，對siRNAs的抑制活性與抑制效率進行了檢測。結(jié)果顯示，(i)通過T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄的方法，在24h內(nèi)能大量獲得長度為21bp的特定siRNAs；通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，可實現(xiàn)siRNAs向靶細胞內(nèi)的高效遞呈；并且，HEK293-T能高效表達mce1a基因，可作為相關(guān)研究的理想細胞株。(ii)在轉(zhuǎn)錄水平，si410和si312對mce1amRNA的抑制效率達90％和88％，均接近siEGFP(92％)；在翻譯水平，si

11、410和si312對Mce1A蛋白的抑制效率達51％和49％，略低于siEGFP(70％)。(iii)Westernblot顯示，在約85kDa處呈現(xiàn)兩條緊密條帶，推測Mce1A-EGFP在HEK293-T細胞內(nèi)表達時，部分融合蛋白可能會發(fā)生糖基化修飾。(iv)上述結(jié)果還提示，靶向相同基因的不同siRNAs，其達到相同抑制效率的起效時間有所不同，推測可能與不同siRNAs參與形成的RISC復(fù)合物切割靶mRNA效率不同有關(guān)。 再次

12、，在上述研究基礎(chǔ)上，探討了Mce1A蛋白介導(dǎo)細菌侵襲的作用機制。一方面，在已獲得純化T-Mce1A蛋白以及高效、特異抑制活性siRNAs的基礎(chǔ)上，分別以正向(不同濃度T-Mce1A刺激)和反向(si410干擾Mce1A表達水平)分析的方法，探討了T-Mce1A對巨噬細胞TLR-2受體及相關(guān)信號分子水平的影響。另一方面，以能表達完整Mce1A的重組E.coli對RAW264.7和CT26.CL25細胞進行了體外侵襲實驗。結(jié)果顯示，(i)T

13、-Mce1A刺激可直接導(dǎo)致RAW264.7細胞TLR-2表達上調(diào)，并進一步引起下游的炎癥性信號分子IRAK-1和TRAF-6表達增高；其中，IRAK-1的表達水平改變尤為顯著。鑒于TLR-2、IRAK-1及TRAF-6的活化可導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，而NF-κB在細胞炎癥反應(yīng)中起中心調(diào)控作用，因此，Mce1A蛋白對TLR-2乃至IRAK-1和TRAF-6的激活作用，可能是Mtb引發(fā)宿主細胞炎癥應(yīng)答反應(yīng)的重要因素之一。(ii)重組

14、菌獲得了侵襲及細胞內(nèi)生存能力，能在RAW264.7細胞內(nèi)生存至少48h；并且，受染細胞出現(xiàn)系列病理性變化。尤其在RAW264.7細胞，重組菌可引起細胞及細胞核明顯變大、細胞膜顯著突起，甚至導(dǎo)致多個細胞的融合，這些形態(tài)學(xué)變化提示了細胞骨架的改變。這進一步提示，表達Mce1A的重組E.coli具有一定侵襲性作用，可在一定程度上逃避巨噬細胞的免疫清除；并且，Mce1A蛋白介導(dǎo)的侵襲性作用可能與靶細胞發(fā)生骨架重排有關(guān)。 總之，綜合分析本

15、研究的上述結(jié)果，可初步推斷，Mce1A蛋白可能通過激活TLR-2受體及其下游IRAK-1等炎癥性信號分子，從而參與調(diào)節(jié)宿主炎癥應(yīng)答反應(yīng)，最終介導(dǎo)了Mtb的侵襲過程，并促使入侵的Mtb在逃避宿主免疫清除后直接引發(fā)疾病或進入潛伏狀態(tài)。結(jié)合近年關(guān)于李斯特菌、沙門菌、志賀菌、耶爾森菌及鳥分枝桿菌復(fù)合物(MAC)侵襲性機制的文獻報道，可進一步提出：(i)Mtb可能具有與MAC相同或相似的侵襲機制——“拉鏈-觸發(fā)”雙重機制；(ii)Mce1A參與的

16、宿主炎癥應(yīng)答調(diào)節(jié)作用，有可能是“拉鏈-觸發(fā)”等相關(guān)骨架重排的重要始動因素之一。 三、微生物16SrDNAsFQ-PCR快速分類與鑒定對58株細菌、衣原體和支原體的16SrDNAs或真菌的18～28SrDNA進行多序列比對與進化樹分析，選擇高度同源區(qū)域設(shè)計通用引物，選擇不同菌株的特異性序列設(shè)計特異引物。提純綠膿桿菌、金黃及檸檬色葡萄球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、福氏志賀菌、變形桿菌、表皮及溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、炭疽桿

17、菌、結(jié)核桿菌、解脲脲原體、白色念珠菌及克柔氏念珠菌等數(shù)十種標(biāo)準(zhǔn)和(或)臨床菌株總DNA。分別以通用和特異引物對上述所有細菌16SrDNA靶片斷進行PCR擴增，并構(gòu)建重組pMD18-T作為FQ-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。以TaKaRaSYBR(R)PremixExTaqTM試劑建立20μl反應(yīng)體系，對梯度稀釋的各總DNA樣品進行FQ-PCR分類鑒定。進化樹分析結(jié)果表明，16S(18～28S)rDNA可作為細菌、衣原體、支原體及真菌快速分類鑒定