寄生疫霉菌小RNA多樣性及其參與基因表達調(diào)控的探索研究.pdf

1、卵菌是一類形態(tài)上與真菌相似，但進化上和動植物以及真菌關系較遠的真核微生物。其中疫霉屬（Phytophthora）卵菌的多個病原物在世界范圍內(nèi)引起毀滅性的植物病害，每年造成嚴重的經(jīng)濟損失。由于進化上的獨特性，卵菌在生理生化和侵染機制上與真菌差異很大，導致許多對真菌有效的殺菌劑對卵菌無效。因此探索疫霉菌-植物互作機制在植物病理學研究和田間生產(chǎn)實踐中都具有重要的意義。
　　另外，抗病品種的使用在田間病害防控中發(fā)揮著重要的作用，但疫霉菌毒

2、性變異迅速，常通過丟失、突變無毒基因來逃避寄主抗病基因的識別，造成對應抗病品種失效。然而一些毒性菌株中的無毒基因尚未發(fā)生任何突變但基因不表達，這說明表觀遺傳學調(diào)控可能參與調(diào)節(jié)寄生疫霉菌毒性變異。基于此，我們分析了寄生疫霉菌(P.parasitica)小RNA的特點以及其在沉默內(nèi)源基因尤其是致病相關基因方面發(fā)揮的功能。同時，為了了解疫霉菌-植物互作機制，我們圍繞寄生疫霉菌-本氏煙模式互作體系，從基因組學和轉(zhuǎn)錄組學角度分析寄生疫霉菌與寄主植

3、物親和互作的分子機制。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過高通量測序技術對寄生疫霉菌小RNA多樣性的研究發(fā)現(xiàn):
　　(a)寄生疫霉菌累積大量的25-26nt和少量21nt小RNA，同時也累積一系列侵染階段高度誘導表達的29nt和33nt的tRNA來源的小RNA。25-26nt小RNA和21nt小RNA具有強烈的5'堿基偏好性，無鏈特異性地成簇分布在基因組上。
　　(b)超過7000個內(nèi)源基因位點累積25-26n

4、t小RNA，轉(zhuǎn)錄組測序表明這些基因一般在營養(yǎng)生長階段和侵染階段均不表達，qPCR實驗支持轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果。小RNA在外顯子、內(nèi)含子以及基因上下游區(qū)域均勻累積，說明基因沉默可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
　　(c)累積25-26nt小RNA的基因主要為寄生疫霉菌特有的基因，包含大約40％的RXLR效應基因、50％的Crinkler效應基因和一些激發(fā)子基因，說明25-26nt小RNA在新基因沉默和寄生疫霉菌毒性變異中可能發(fā)揮重要作用。
　

5、　(d)25-26nt小RNA主要來源于基因稀疏區(qū)和基因密集區(qū)，且小RNA的產(chǎn)生和沉默狀態(tài)能從重復區(qū)向兩側(cè)傳播幾百堿基到上千堿基距離。與此呼應，累積小RNA的內(nèi)源基因大部分位于或十分鄰近重復區(qū)域。(e)21nt小RNA主要來源于高表達基因的外顯子區(qū)，其累積不足以導致基因完全沉默，且小RNA的產(chǎn)生可能依賴基因表達。(f)對已公布的致病疫霉菌的小RNA和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重新分析的結(jié)果表明，致病疫霉菌中25-26nt小RNA，而不是21nt小RNA

6、，也與內(nèi)源基因的沉默密切相關，這說明這一現(xiàn)象在疫霉菌中是保守的。
　　2.通過對寄生疫霉菌侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)離體葉片不同時間點(0、3hpi、6hpi、12hpi、24hpi、48hpi)的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析。
　　結(jié)果表明：
　　(a)侵染階段早期和晚期基因表達差異很大，大量致病相關基因在侵染階段早期上調(diào)表達而在晚期下調(diào)表達?；诖?，我們鑒定了231個侵染階段早期特異性高表

7、達的編碼分泌蛋白的基因，這包括大量編碼RXLR效應蛋白、NPP樣激發(fā)子以及各種水解酶和蛋白酶抑制劑的基因。同時還發(fā)現(xiàn)編碼鹽酸小檗堿樣蛋白、碳酸酐酶和SCP樣胞外蛋白的三個家族基因以及多個功能未知的基因家族在侵染階段早期特異性高表達。我們圍繞其中一個家族進行系統(tǒng)地分析，發(fā)現(xiàn)其家族成員在疫霉中頻繁復制且出現(xiàn)顯著的結(jié)構(gòu)域重排現(xiàn)象，根據(jù)結(jié)構(gòu)域排列特點可將其分成三個亞家族。
　　(b)大量蛋白翻譯、核小體組裝以及RNA甲基化相關基因在侵染早

8、期顯著上調(diào)表達，而三羧酸循環(huán)和ATP合成相關基因在侵染中后期上調(diào)表達。但與預期不符的是，囊泡介導的轉(zhuǎn)運、微管介導的細胞運輸、蛋白降解、蛋白磷酸化和信號傳導相關基因在侵染階段顯著下調(diào)表達。
　　3.此外，我們利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對本氏煙基因轉(zhuǎn)錄本進行了組裝和表達分析，并且通過鑒定抗病相關的基因來探索寄主植物防御疫霉菌的分子機制。
　　結(jié)果表明：
　　(a)包括活性氧迸發(fā)和程序化細胞壞死相關基因和PAMP誘導的基因在內(nèi)的大量防御

9、反應基因在侵染階段上調(diào)表達。水楊酸、茉莉酸和乙烯的合成和信號通路相關基因均上調(diào)表達，進一步分析表明這些激素相關基因以及flg22/elf18誘導表達的基因絕大部分在侵染階段上調(diào)表達，且在3hpi和24hpi出現(xiàn)兩個表達高峰，這可能是大部分抗病相關基因的重要特征。基于此，我們鑒定到了3766個在3hpi和24hpi出現(xiàn)兩個表達高峰的基因作為候選的抗病相關基因，其中753個在3hpi上調(diào)超過10倍。
　　(b)系統(tǒng)地鑒定了本氏煙中的蛋

10、白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，它們大部分也在3hpi和24hpi出現(xiàn)兩個表達高峰。我們進一步鑒定到了在3hpi和24hpi出現(xiàn)兩個表達高峰的一系列受體樣蛋白激酶和4個受體樣蛋白，為PAMP/激發(fā)子受體篩選提供了重要的候選。
　　(c)大量蛋白分泌、蛋白修飾以及包括糖異生、脂肪酸氧化以及三羧酸循環(huán)在內(nèi)的分解代謝過程相關基因在侵染階段顯著上調(diào)表達;而以蛋白翻譯、脂肪酸和糖類合成為代表的大量生物合成相關通路、光合作用以及離子轉(zhuǎn)運等基礎代謝過程相關基