華南瓜類疫霉種群多樣性及其化學防治研究.pdf

1、由疫霉菌引起的瓜類疫病是世界性病害，據(jù)報道，該病由多種疫霉菌引起，目前該病已成為瓜類生產(chǎn)中危害最嚴重的病害之一；因病原菌的多樣化和抗藥性使得對該病的防治極為困難。為了解近年華南地區(qū)冬瓜及黃瓜疫病病原菌的構成和病原種群的動態(tài)變化，本文對近4年來從廣西和廣東兩省(區(qū))不同瓜類產(chǎn)區(qū)分離到的193株疫霉菌進行系統(tǒng)研究，從形態(tài)學和分子生物學方面進行了鑒定，測定了部分代表菌株的生物學特性，開展了病原菌的抗藥性檢測與監(jiān)測、交配型及其分布調(diào)查、致病性分

2、化及遺傳多樣性的RAPD分析研究，并對冬瓜疫病的化學防治進行了初步研究。主要研究結果如下：
　　 1、2007～2010年從廣西、廣東兩省(區(qū))9個冬瓜、黃瓜產(chǎn)區(qū)采集疫病病株，經(jīng)分離純化共獲得193株疫霉菌，對其中10株代表菌株的形態(tài)、培養(yǎng)性狀、寄主范圍等生物學特性進行了研究，并對其中89株的rDNA-ITS區(qū)域的序列進行了分析。結果表明，在OA培養(yǎng)基上，10株代表菌株(CZ-1，GL-9，GZ-4，LZ-5，NN-20，NN-

3、27，NN-29，YD-6，YL-2和YL-9)氣生菌絲較均勻一致，基質(zhì)菌絲膨大體常見。孢子囊呈卵形、橢圓形到長橢圓形，無乳突，孢囊梗不脫落。孢囊梗一般不分支，孢子囊有內(nèi)層出現(xiàn)象。絕大多數(shù)菌株表現(xiàn)異宗配合特性，藏卵器球形，壁光滑，基部多呈棍棒形，雄器穿雄生。卵孢子球形，滿器，偶有不滿器。最適生長溫度25～31℃，最高生長溫度高于37℃。最適生長pH值范圍5～7.5，但多數(shù)菌株在偏酸性(pH5～6)條件下生長較好。病原菌能利用多種碳氮源，

4、對孔雀石綠有一定的耐性，人工接種能嚴重侵染冬瓜、黃瓜、節(jié)瓜、西瓜、甜瓜等葫蘆科作物，對茄科、十字花科、傘形科的部分植物(如馬鈴薯、大白菜、上海青、胡蘿卜)也具較強致病力。將89株供試菌的rDNA-ITS序列與在GenBank中已有的相關菌株的rDNA-ITS序列進行同源性比較，結果表明所有供試菌株與瓜類疫霉Phytophthora melonis和中國疫霉P.sinensis的同源性最高。對基于rDNA-ITS序列構建的48株疫霉菌的分

5、子系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析結果表明，在自舉值為99%的水平上供試10株代表菌株與瓜類疫霉P.melonis和中國疫霉P.sinensis聚成一群，明顯不同于34株其他疫霉菌，表明供試瓜類疫病菌株應歸入瓜類疫霉P.melonis和中國疫霉P.sinensis種內(nèi)。結合病原菌的形態(tài)學、生物學及rDNA-ITS序列分析，將引起華南廣東、廣西兩省(區(qū))冬瓜及黃瓜疫病的病原菌鑒定為瓜類疫霉P.melonis(異名：P.sinensis)。
　　

6、 2、采用菌絲塊無傷接種法，測定193株瓜類疫霉對供試寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力差異及其寄主嗜好性。結果表明，病原群體對寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力均存在明顯分化現(xiàn)象，可分為強致病力、中等致病力及弱致病力3大類群；來自不同地區(qū)的瓜類疫霉對寄主植物冬瓜和黃瓜的致病力明顯不同，多數(shù)樣區(qū)以強致病力菌株占優(yōu)勢。瓜類疫霉種群中至少存在3種寄主嗜好型(A，B和C型)菌株，A型菌株對冬瓜和黃瓜均表現(xiàn)強致病力，與原始分離寄主無關；B型菌株僅對原始分離寄主

7、冬瓜表現(xiàn)強致病力，而對黃瓜則表現(xiàn)為弱或中等致病力；C型菌株僅對原始分離寄主黃瓜表現(xiàn)強致病力，而對冬瓜則表現(xiàn)為弱或中等致病力。本研究明示了華南瓜類疫霉致病力分化的存在。
　　 3、對從華南地區(qū)分離到的193株瓜類疫霉進行抗藥性檢測，結果表明，敏感菌株、中等抗性菌株和抗性菌株分別占測試菌株的29.0%、18.1%和52.8%；不同地區(qū)、不同寄主分離的菌株的抗性頻率和抗性水平差異較大，來源于廣東的菌株抗性頻率和抗性水平一般高于來源廣西

8、的菌株，分離自黃瓜的菌株高于分離自冬瓜的菌株。大部分樣點抗性菌株占據(jù)優(yōu)勢群體，個別菌株的抗性指數(shù)高達4226.9。葉盤漂浮法測定結果和菌落生長速率法相似。在含藥平板上對敏感菌株進行甲霜靈抗性誘導結果表明，從60%的敏感菌株中成功誘導出對甲霜靈抗性穩(wěn)定的突變體，突變體的抗性水平為敏感性親本的189～407倍；9株來源于未施用過甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑樣點的菌株均為敏感性菌株，其EC50值為0.0429～0.5461μg/mL，將它們EC5

9、0的平均值0.3200±0.1617μg/mL確定為華南地區(qū)瓜類疫霉對甲霜靈的敏感性基線；對兩個樣點的監(jiān)測結果表明，瓜類疫霉抗甲霜靈菌株的頻率及抗性指數(shù)有逐年增高趨勢。華南廣西和廣東兩省(區(qū))瓜類疫霉對甲霜靈抗性普遍發(fā)生，瓜類疫霉對甲霜靈抗藥性產(chǎn)生與其和藥劑的接觸密切相關。
　　 4、采用直接配對法對193株瓜類疫霉進行交配型測定，共檢測到5種交配型。各種交配型中，以A2交配型占據(jù)優(yōu)勢，占群體的51.8%；其次為A0交配型占24

10、.9%；A1，A2交配型的比例最少，僅2株占1.0%。桂林的瓜類疫霉以A0交配型占優(yōu)勢，比例為40.9%，其它地區(qū)的瓜類疫霉則以A2交配型占據(jù)優(yōu)勢，比例為37.5～66.7%，來自兩種寄主的瓜類疫霉都檢測到4種交配型的存在，且均以A2交配型占優(yōu)勢，其中3種交配型(A2、A1A2和A0)為來自兩種寄主的瓜類疫霉所共有，A1交配型為冬瓜疫病菌獨有，而A1，A2則為黃瓜疫病菌獨有，表明瓜類疫霉的部分交配型菌株對寄主有?；?。桂林的瓜類疫霉的A

11、1和A2交配型菌株數(shù)比值接近1:1，初步確定桂林處于瓜類疫霉起源中心的范圍內(nèi)，可以推測亞洲是瓜類疫霉的起源中心。
　　 5、從180條RAPD(random amplified polymorphic DNAs)隨機引物中所篩選出的多態(tài)擴增性強、重復性好的12條引物，對華南9個不同地區(qū)的96株瓜類疫霉進行全基因組DNA遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建。選用引物對供試菌株進行RAPD-PCR擴增，共產(chǎn)生135條DNA標記圖帶，其中12

12、4條為多態(tài)性圖帶，多態(tài)檢測率為91.9%。利用NTSYSpc Version2.1軟件對供試菌株間的遺傳距離進行聚類分析并構建系統(tǒng)樹狀圖，以遺傳相似系數(shù)為0.81為閾值，將96株供試菌劃分為12個RAPD群，多數(shù)分離物之間遺傳相似性較低，在DNA水平上存在顯著的遺傳變異，具有較豐富的遺傳多樣性。RAPD群的劃分與地理來源、分離寄主、致病力、交配型及甲霜靈抗性水平等表型特征均無明顯的相關性。研究結果顯示，不同地區(qū)間菌株的遺傳分化不同，分離

13、自黃瓜的菌株其遺傳分化明顯高于分離自冬瓜的菌株。
　　 6、為了篩選出防治瓜類疫霉所致黑皮冬瓜疫病的高效藥劑，對19種常見商品殺菌劑對瓜類疫霉的室內(nèi)抑制力進行了測定，并對部分殺菌劑進行冬瓜疫病的盆栽和大田防效試驗。室內(nèi)抑制力測定結果表明：烯酰嗎啉(商品名：安克)和氟嗎啉+代森錳鋅(商品名：施得益)對病原菌的抑制力最強，生長抑制率分別為89.36%和87.43%；其余依次為霜脲氰+代森錳鋅(商品名：克露)53.07%、甲霜靈+代森

14、錳鋅(商品名：金雷多米爾)51.43%、噁霜靈+代森錳鋅(商品名：殺毒礬)46.57%、代森錳鋅(商品名：大生M-45)46.00%、敵磺鈉(商品名：敵克松)45.86%、乙磷鋁+代森鋅40.43%；其它殺菌劑對病原菌的生長抑制率均在40%以下；嘧菌酯(商品名：阿米西達)、異菌脲(商品名：撲海因)和惡霉靈的毒性最弱，抑制率均為0%。盆栽試驗結果表明：烯酰嗎啉和氟嗎啉+代森錳鋅有很好的保護作用，防治效果達100%；其次為敵磺鈉、百菌清、乙