依達(dá)拉奉對慢性腦低灌注大鼠腦自由基代謝及海馬CA1區(qū)HIF-1α表達(dá)的影響.pdf

1、目的：慢性腦低灌注狀態(tài)是是血管性癡呆(vasculardementia，VD)、Alzheimer's病(AD)和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過程中的一個(gè)共同病理過程。在我國，VD是老年期癡呆的主要組成部分。VD不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的健康，也給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前，VD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，也無特殊有效的治療方法，因此探討VD的發(fā)病機(jī)理，制定合理的治療方案，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題。 目前認(rèn)為慢性腦低灌注是VD的

2、主要原因。有研究表明，在低灌注狀態(tài)及低代謝狀態(tài)下認(rèn)知功能可發(fā)生減退，而腦部自由基代謝的紊亂是低灌注時(shí)產(chǎn)生腦實(shí)質(zhì)和腦微血管系統(tǒng)損害的重要的可能機(jī)制。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)作為體內(nèi)清除超氧陰離子的特異酶，其變化間接反應(yīng)了體內(nèi)清除自由基的能力變化。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝終產(chǎn)物，間接反應(yīng)了體內(nèi)自由基損傷引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱。腦缺血后脂質(zhì)過氧化活躍，M

3、DA產(chǎn)生增多，SOD則因消耗增多而減少。缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是近幾年發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)失衡的一個(gè)核心調(diào)節(jié)因子，在低氧狀況下誘導(dǎo)產(chǎn)生并發(fā)揮多方面效應(yīng)。有研究表明，HIF-1α可能參與了慢性低灌注大鼠的代償與適應(yīng)機(jī)制。依達(dá)拉奉作為一種氧自由基清除劑對急性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用引起了人們越來越多的關(guān)注。但國內(nèi)外有關(guān)依達(dá)拉奉神經(jīng)保護(hù)作用的大部分研究都集中在急性缺血模型，有關(guān)依

4、達(dá)拉奉作用于慢性腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道尚缺乏。本實(shí)驗(yàn)通過模擬人類慢性腦低灌注的大鼠動(dòng)物模型，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶、前腦組織SOD活力和MDA含量及海馬CA1區(qū)HIF-1a的表達(dá)變化并觀察新型自由基清除劑依達(dá)拉奉對它們的影響，在揭示了VD發(fā)病機(jī)制的同時(shí)也為臨床治療血管性認(rèn)知功能障礙提供一個(gè)新的思路。 方法：雄性SD大鼠84只，月齡3-4個(gè)月，體重280～340g，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(n=20)，生理鹽水組(n=32)，依達(dá)拉奉組(

5、n=32)。各組又隨機(jī)分為6周組和8周組。生理鹽水組和依達(dá)拉奉組大鼠按照de la Torre等[1]方法，行雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，余處理同生理鹽水組和依達(dá)拉奉組。依達(dá)拉奉組手術(shù)第4周后腹腔注射依達(dá)拉奉5mg·kg-1·d-1，六周組共注射2周，八周組共注射4周，生理鹽水組腹腔注射等劑量生理鹽水。各組大鼠術(shù)后分別在各時(shí)間點(diǎn)水迷宮測試后斷頭在冰盤上快速取腦，去除腦干及小腦，置0～4℃生理鹽水中漂洗，除

6、去血液，濾紙拭干。視交叉后1mm及4mm冠狀切開腦組織，取中間切塊為海馬組織，系列固定、脫水、浸蠟、包埋制成石蠟切片，行HE染色和免疫組化染色觀察海馬病理變化和HIF-1a表達(dá)變化，運(yùn)用Image-Pro Plus圖象分析軟件對各組大鼠海馬組織CAl區(qū)相同面積內(nèi)HIF-1a陽性細(xì)胞測定累計(jì)光密度(IOD)。取視交叉前腦組織分別檢測SOD活力和MDA含量。運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行各組間的兩兩

7、比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：(1)各組大鼠存活情況：假手術(shù)組(包括6周組和8周組)死亡0只，生理鹽水6周組、8周組分別死亡5只、6只，死亡率分別為31.3％和37.5％。依達(dá)拉奉6周組、8周組分別死亡5只、4只，死亡率分別為3 1.3％和25％。各組存活大鼠作為研究對象。(2)水迷宮試驗(yàn)：生理鹽水6周組、生理鹽水8周組大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績顯著下降，表現(xiàn)為尋找平臺(tái)潛伏期時(shí)間延長，明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，與生

8、理鹽水6周組相比，生理鹽水8周組大鼠學(xué)習(xí)、記憶成績下降更明顯(P＜0.05)。依達(dá)拉奉6周組、8周組分別與生理鹽水6周組、8周組比較，學(xué)習(xí)、記憶成績均顯著改善(P＜0.05)，與假手術(shù)6周組相比，依達(dá)拉奉6周組學(xué)習(xí)、記憶成績?nèi)杂兴陆?P＜0.05)，依達(dá)拉奉8周組與假手術(shù)8周組相比學(xué)習(xí)、記憶成績無顯著差別(P＞0.05)，與依達(dá)拉奉6周組相比，依達(dá)拉奉8周組學(xué)習(xí)、記憶成績有所改善(尸＜0.05)。(3)海馬HE染色：假手術(shù)組大鼠海馬C

9、Al區(qū)錐體細(xì)胞排列較致密整齊，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，核大而圓，核仁明顯；相比之下，生理鹽水組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，胞體變小，核固縮，胞質(zhì)濃染，且8周組較6周組細(xì)胞缺失、核固縮現(xiàn)象更明顯；依達(dá)拉奉組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，層次尚清，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，核固縮現(xiàn)象較少見，且8周組較6周組改善更明顯。(4)海馬CA1區(qū)HIF-1a表達(dá)變化：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)僅見極少量陽性神經(jīng)

10、元；生理鹽水6周組、8周組可見少量陽性神經(jīng)元，排列松散，胞體變小，核固縮，陽性細(xì)胞累計(jì)光密度(IOD)值高于假手術(shù)組(P＜0.05)；生理鹽水6周組與8周組比較IOD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；依達(dá)拉奉6周組、8周組海馬CA1區(qū)均可見有大量HIF-1α陽性神經(jīng)元分布，陽性物質(zhì)主要位于胞漿內(nèi)，胞核也有少量表達(dá)，細(xì)胞排列較整齊緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見突起；與假手術(shù)6周組及生理鹽水6周組相比，依達(dá)拉奉6周組陽性

11、神經(jīng)元IOD值明顯增高(P＜0.01)；與假手術(shù)8周組及模型8周組相比，依達(dá)拉奉8周組陽性神經(jīng)元IOD值明顯增高(P＜0.01)，且亦高于依達(dá)拉奉6周組(P＜0.05)。(5)SOD、MDA測定結(jié)果情況：與假手術(shù)組相比，生理鹽水6周組、8周組前腦組織SOD活力下降，MDA含量增加(P＜0.05)。生理鹽水6周組與8周組相比，生理鹽水8周組SOD活力下降進(jìn)一步下降，MDA含量進(jìn)一步增加(P＞0.05)；與生理鹽水6周組相比，依達(dá)拉奉6周組

12、SOD活力有所增加，MDA含量有所下降(P＜0.05)。與生理鹽水8周組相比，依達(dá)拉奉8周組SOD活力明顯增加，MDA含量明顯下降(P＜0.01)，且與依達(dá)拉奉6周組相比SOD活力亦有所增加，MDA含量有所下降(P＜0.05)。 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功地建立了慢性腦低灌注大鼠模型(2-VO)，水迷宮試驗(yàn)證實(shí)了模型大鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，海馬HE染色顯示錐體細(xì)胞受損能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，同時(shí)，也證實(shí)了依達(dá)拉奉的治療

13、效果。(2)采用免疫組織化學(xué)方法，證實(shí)了在慢性腦低灌注狀態(tài)下大鼠海馬組織HIF-1α表達(dá)增加，可能參與了慢性腦缺血的代償與適應(yīng)機(jī)制。分別采用黃嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸顯色法測定2-VO大鼠前腦組織SOD活性及MDA含量，證實(shí)了2-VO后腦組織SOD活性下降，MDA含量增加。依達(dá)拉奉治療后大鼠海馬組織HIF-1α表達(dá)明顯增加，前腦組織SOD活性明顯增強(qiáng)，MDA含量明顯下降，表明依達(dá)拉奉可能通過促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，抑制黃嘌呤氧化酶和次黃嘌