新型大鼠腦膠質瘤動物模型的建立及基因治療的實驗研究.pdf

1、目的：通過探討利用腺病毒（Adenovirus，Ad）提高腺相關病毒（Adeno-associated Virus，AAV）對大腦皮層神經(jīng)元轉導效率的可行性、建立一種新的觀察腫瘤細胞生長和遷移的膠質瘤（Glioma）原位移植動物模型及運用血管內皮抑素（Endostatin）基因轉染的方法觀察膠質瘤體內生長情況等角度，來初步闡明開展膠質瘤基因治療研究的動物模型和實驗方法。 方法：采用不同滴度的Ad與一定滴度的帶有熒光素酶（Luci

2、ferase）報告基因的AAV-Luc一起聯(lián)合感染體外培養(yǎng)的Balb/C小鼠大腦皮層神經(jīng)元，感染后72小時，裂解細胞提取Luciferase蛋白，通過測定熒光素酶活性觀察轉導效率；此后將一定滴度的Ad與AAV-Luc一起直接注入小鼠大腦皮層，2周后，用小動物活體成像儀觀察神經(jīng)組織熒光素酶的表達。利用脂質體轉染法將含有增強的綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）基因的真核表達質粒pE

3、GFP-N1及含有血管內皮抑素（Endostatin）基因的真核表達質粒pSNAV-ENDO分別轉至大鼠膠質瘤C6細胞，經(jīng)G418篩選及亞克隆，獲取穩(wěn)定表達EGFP及Endostatin的細胞系C6-gfp和C6-endo。采用CCK-8試劑盒檢測C6及C6-gfp細胞生長情況，接種C6-gfp細胞于Wistar大鼠顱內，通過B超、大體標本、熒光體視鏡、HE染色和免疫組化觀察顱內成瘤情況及綠色熒光蛋白的表達；將細胞C6、C6-gfp和C

4、6-endo各自接種于裸鼠皮下，觀察它們之間成瘤的差異。 結果：Ad在體內外均能明顯提高AAV對小鼠大腦皮層神經(jīng)元的轉導效率。體外穩(wěn)定轉染的C6-gfp細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測97.7％產生綠色熒光，C6-gfp與親代C6相比，生長曲線無明顯不同（P>0.05）,C6-gfp接種于Wistar大鼠顱內3周后成瘤率達70％，利用B超可動態(tài)觀察腫瘤生長，利用熒光體視鏡可見腫瘤組織發(fā)綠色熒光，能與周圍正常組織區(qū)別。裸鼠體內成瘤實驗顯示，