rAAV-HIF-1α-siRNA聯(lián)合抗壞血酸對人胰腺癌MiaPaC2細(xì)胞糖代謝的影響.pdf

1、胰腺癌為高度惡性的乏血管腫瘤，其組織中有高豐度的HIF-1α表達(dá)，而HIF-1α在腫瘤細(xì)胞缺氧自適應(yīng)過程中對腫瘤細(xì)胞的糖代謝起著重要調(diào)節(jié)作用。因此，以HIF-1α為靶點有望成為治療胰腺癌的有效手段。當(dāng)前，RNAi技術(shù)可以高效、特異性地促使靶基因mRNA的降解，阻斷靶基因的表達(dá)，達(dá)到基因敲除的效果。而作為基因治療的載體——腺相關(guān)病毒(AAV)，因其無致病性、無免疫原性、可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞等特點被認(rèn)為是抗腫瘤基因治療的最理想載體，而

2、抗壞血酸具有促進(jìn)HIF-1α蛋白降解的作用。 因此，本實驗將以重組腺相關(guān)病毒(rAAV)為載體介導(dǎo)以HIF-1α為靶點的siRNA，聯(lián)合抗壞血酸，作用于MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞，厭氧培養(yǎng)條件下觀察其對糖代謝反應(yīng)關(guān)鍵酶——葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(G1ut-1)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討基因聯(lián)合藥物治療胰腺癌提供一些理論依據(jù)。 方法: 1．提取和擴(kuò)增載體質(zhì)粒pAAV-hrGFP和pAAV-Hl-siRNA-hrGFP及輔助

3、質(zhì)粒 pAAV-RC、pAAV-Helper；應(yīng)用磷酸鈣沉淀三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK93細(xì)胞法包裝 rAAV；提取和純化rAAV并計算其滴度；再應(yīng)用rAAV轉(zhuǎn)染MiaPaca2人胰腺癌細(xì)胞，利用GFP觀察熒光表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染效果。 2．對于厭氧培養(yǎng)下的MiaPaCa2人胰腺癌細(xì)胞，分5組并給予不同處理因素，(①空白對照組、②空載病毒組、③單純抗壞血酸組、④單純rAAV-H1-siRNA-hrGFP組、⑤rAAV-Hl-siRNA-hrGF

4、P聯(lián)合抗壞血酸組)，24和48小時后，應(yīng)用蛋白印跡法觀察對MiaPaCa2人胰腺癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響，應(yīng)用RT-PCR法和蛋白印跡法分別觀察對MiaPaCa2人胰腺癌細(xì)胞Glm-1基因及蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1．成功包裝了rAAV，其形態(tài)正常、純度滿意、滴度達(dá)4×10<'13>particles/ml。將rAAV-HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染Mi＃aC2人胰腺癌細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)。

5、 2．Western Blot研究發(fā)現(xiàn)，rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate作用于 MiaPaC2細(xì)胞24h后，與對照組比，HIF-1α蛋白明顯下降；在聯(lián)合組中， 48h下降更為顯著。應(yīng)用RT-PCR法檢測各不同處理因素對MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞Glut-1 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)rAAV-HIF-1α-siRNA和抗壞血酸有抑制MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞Glut-1 mRNA表達(dá)的作用，與對照組相比，差異有顯著性)

6、，而rAAV_hrGFP對MiaPaC2細(xì)胞Glut-1 mRNA的表達(dá)無任何影響，且rAAV-HIF-1α-siRNA抑制Glut-1 mRNA的表達(dá)在48小時到達(dá)高峰，明顯超過其在24小時的作用；應(yīng)用WestemBlot檢測發(fā)現(xiàn)，rAAV-Hl-siRNA-hrGFP處理組、抗壞血酸處理組及 rAAV-Hl-siRNA-hrGFP聯(lián)合抗壞血酸處理組的Glut-1蛋白的表達(dá)，與對照組相比，有顯著性差異；而rAAV-hrGFP組與對照組

7、相比，Glut-1蛋白的表達(dá)未見明顯顯著性差異，且24小時Glut-1蛋白的表達(dá)便明顯下降，48小時下降更加顯著。 結(jié)論: 1．成功包裝rAAV，其形態(tài)、純度及滴度滿意，且能成功的轉(zhuǎn)染MiaPaC2人胰腺癌細(xì)胞。 2．rAAV-HIF-1α-siRNA和L-ascorbate都可抑制MiaPaC2細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)，并且其聯(lián)合作用大于其單獨作。rAAV-Hl-siRNA-hrGFP和抗壞血酸都有抑制MiaP