青風(fēng)藤提取物的藥學(xué)和藥理學(xué)初步研究.pdf

1、目的：本課題研究目的是開發(fā)中藥青風(fēng)藤中對(duì)抗阿片類藥物依賴、治療戒斷癥狀的天然有效成分，并進(jìn)行初步的藥效學(xué)研究。采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選切合實(shí)際的最佳制劑工藝。質(zhì)量控制方面將對(duì)青風(fēng)藤中所含主要活性成分青藤堿進(jìn)行薄層色譜定性鑒別的研究，并采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定研究，初步確定其含量限度。對(duì)本研究所采用的含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)研究，制訂控制該制劑質(zhì)量的質(zhì)控指標(biāo)。通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，觀察青風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)及死亡情況，為該藥臨床應(yīng)用的

2、安全性提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)動(dòng)物模型，觀察青風(fēng)藤提取物對(duì)嗎啡依賴大、小鼠催促戒斷癥狀的治療作用，為青風(fēng)藤提取物的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。 方法： 1．青風(fēng)藤提取工藝考察實(shí)驗(yàn)：對(duì)有效成分含量影響較大的因素有煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、作為溶劑的乙醇濃度，加入溶劑的量等。根據(jù)青藤堿既溶于水又可溶于醇的特性，選用不同濃度的乙醇為溶劑，將乙醇濃度和煎煮時(shí)間、次數(shù)及溶液用量構(gòu)成四個(gè)主要影響因素，每因素各設(shè)3水平，因此，選用L9(3<'4>)正

3、交設(shè)計(jì)表。按正交表中給定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，以平均青藤堿的含量(mg/ml)為考察指標(biāo)篩選最佳條件。 2 青風(fēng)藤提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按最佳工藝驗(yàn)證3批，取相當(dāng)與1g生藥量的干膏測(cè)青藤堿的含量。 3 青風(fēng)藤定性鑒別實(shí)驗(yàn)：照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部，附錄VI B)試驗(yàn)，吸取青風(fēng)藤成品供試品溶液10μl，青風(fēng)藤對(duì)照藥材溶液10μl，青藤堿對(duì)照品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一2％氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層

4、板上，以甲苯-甲醇-乙酸乙酯-水(2:2:4: 1)10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。依次噴碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。 4青風(fēng)藤含量測(cè)定波長(zhǎng)選擇：按色譜條件對(duì)對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)青藤堿對(duì)照品和樣品中青藤堿的紫外吸收?qǐng)D譜，確定青藤堿最大吸收波長(zhǎng)。 5 青藤堿對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15、20

5、、30μl，在高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱座標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6 精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取青藤堿對(duì)照品溶液10μl，重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定供試品中青藤堿的峰面積值。 7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，分別在制備后0、2、16、18、22小時(shí)進(jìn)行青藤堿峰面積測(cè)定，每次進(jìn)樣10μl。 8 重現(xiàn)性試驗(yàn)：同一批樣品干膏精密稱取樣品1g，共5份，制備成供試品溶液，按選定的方法測(cè)定，每次進(jìn)樣10μ

6、l。 9 回收率測(cè)定：取青風(fēng)藤干膏共5份，分別精密稱取1g，按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定其青藤堿的含量，精密加入青藤堿對(duì)照品(青藤堿含量為2.722mg/ml)1ml，計(jì)算青藤堿的回收率。 10 樣品中青藤堿的含量測(cè)定：取本品，胺照供試品溶液制備方法制備，按選定的方法，自動(dòng)進(jìn)樣供試品溶液10μl，測(cè)定供試品溶液中青藤堿的峰面積值，計(jì)算含量。 11 青風(fēng)藤提取物急性毒性試驗(yàn)：取昆明小鼠40只，♂♀各半，隨機(jī)分成2組(n=

7、20)，即空白對(duì)照組、青風(fēng)藤提取物組。2組動(dòng)物經(jīng)禁食12h(飲水不限)后，分別 ig 給予等容量生理鹽水和青風(fēng)藤提取物藥液，在一天內(nèi)連續(xù)給藥兩次(9：00，18：00)，給藥后小鼠自由進(jìn)食飲水。藥后24小時(shí)內(nèi)嚴(yán)密觀察受試動(dòng)物的情況，以后每天觀察3次，連續(xù)14天，于第15天稱體重后將小鼠處死，解剖后肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸等主要臟器的病理學(xué)改變。12 對(duì)嗎啡依賴動(dòng)物催促戒斷癥狀的治療實(shí)驗(yàn)： (1)青風(fēng)藤提取物對(duì)嗎啡

8、依賴大鼠戒斷癥狀的治療實(shí)驗(yàn)按劑量遞增法造成嗎啡依賴大鼠模型。取SD大鼠60只，雌雄各半，sc嗎啡，每天3次(8：00、14：00、20：00，)，劑量為5、10mg/kg各4天，15、20mg/kg各3天。注射量為0.2ml/100g。于第15天上午8：00將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，然后分別給予不同的處理：①組為續(xù)用嗎啡組，20mg/kg/日，(0.2ml/100g)；②組為戒斷模型組，ig等容量的生理鹽水；③-⑤分別為青風(fēng)藤提取

9、物低、中、高劑量組，分別ig青風(fēng)藤提取物0.4g/kg、0.8g/kg和1.6g/kg的藥液，各組給藥體積相同(1ml/100g)，但濃度不同；⑥組ig青藤堿45mg/kg。給藥45 min后用納洛酮(4 mg/kg，ip)進(jìn)行催促，觀察記錄大鼠的戒斷反應(yīng)，并于60 min時(shí)稱量大鼠體重。 (2)青風(fēng)藤提取物對(duì)嗎啡依賴小鼠戒斷癥狀的治療實(shí)驗(yàn)按劑量遞增法復(fù)制嗎啡依賴小鼠模型。取昆明小鼠1 00只，雌雄各半，每天給予sc 嗎啡，

10、每天給藥2次(8：30，16：30)，給藥體積為0.2 ml/1 0g。劑量從25 mg/kg起，逐日遞增，于第6天增至1 50 mg/kg，即制成嗎啡依賴的小鼠模型。于第7天進(jìn)行納洛酮催促戒斷試驗(yàn)。各組分別給予不同的處理：①組為空白對(duì)照組，ig等體積生理鹽水(0.2ml/10g)；②-④分別為青風(fēng)藤提取物低、中、高劑量組，按各組劑量0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg，ig給藥，給藥體積相同(均為0.3ml/10g)，濃度不

11、同；⑤組ig青藤堿(60mg/kg)。藥后45min給予納洛酮(8：mg/kg，ip)催促，觀察30min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及1h內(nèi)的體重變化。 結(jié)果： 1．經(jīng)篩選的最佳制劑工藝為：處方藥材加8倍量70％乙醇，提取2次，每次2h。 2按最佳工藝驗(yàn)證3批，取相當(dāng)與1g生藥量的干膏測(cè)青藤堿的含量，結(jié)果青藤堿含量基本穩(wěn)定，說(shuō)明工藝較穩(wěn)定。 3 經(jīng)篩選的最佳制劑工藝所得成品中青風(fēng)藤色譜斑點(diǎn)清晰，與對(duì)照品斑點(diǎn)的位

12、置和顏色均一致。 4 根據(jù)青藤堿對(duì)照品和樣品中青藤堿的紫外吸收?qǐng)D譜，在262nm處有最大吸收，故選定262nm為青藤堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。 5 測(cè)定結(jié)果表明，青藤堿對(duì)照品在進(jìn)樣量2.57μg～15.42μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 6 RSD(％)=0.99，結(jié)果表明精密度良好。 7 結(jié)果表明供試品溶液在制備后22小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。 8 重現(xiàn)性好RSD(％)=1.66，結(jié)果表明，本法測(cè)定青藤堿的重現(xiàn)性良好。

13、 9 回收率為99.49％，RSD(％)=0.66，根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果，表明回收率結(jié)果良好。 10 含量測(cè)定結(jié)果，本品每1g含青風(fēng)藤以青藤堿(c<,19>H<,23>NO<,4>)計(jì)，不得少于4.4 mg。 11 青風(fēng)藤提取物以最大濃度、最大給藥容積一天兩次ig給藥后，觀察14天未見(jiàn)動(dòng)物死亡。 12(1)青風(fēng)藤提取物3個(gè)劑量組的戒斷癥狀分值均低于戒斷模型組，其中中、高劑量組的戒斷癥狀分值略高于單體青藤堿組，但無(wú)

14、明顯差異，P>0.05。 (2)給小鼠連續(xù)sc嗎啡6天后，經(jīng)納洛酮催促，空白對(duì)照組小鼠出現(xiàn)明顯的跳躍反應(yīng)，跳躍小鼠為100％。青風(fēng)藤提取物ig給藥后，各劑量組小鼠出現(xiàn)跳躍反應(yīng)的個(gè)數(shù)及次數(shù)均有所減少，與空白對(duì)照組比較，中、高劑量組及單體青藤堿組均顯著減少，P<0.05。青風(fēng)藤提取物高劑量組與青藤堿組比較，P<0.05，差異顯著。 結(jié)論： 1．工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青藤堿含量基本穩(wěn)定，說(shuō)明優(yōu)選工藝較穩(wěn)定。 2．

15、根據(jù)方法學(xué)研究結(jié)果，試驗(yàn)證明，該含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高重現(xiàn)性好，因此可采用本法測(cè)定青風(fēng)藤提取物中青藤堿的含量。3 青風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠的最大日給藥劑量為64 g/kg，相當(dāng)于臨床成人日用劑量的914倍。表明本品是一種低毒、安全的中藥制劑。 4 嗎啡依賴大鼠催促戒斷治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青風(fēng)藤提取物3個(gè)劑量組在戒斷癥狀最重的前三天均能明顯抑制戒斷大鼠的戒斷癥狀和體重下降。 5 青風(fēng)藤提取物對(duì)嗎啡依賴小鼠催促戒斷癥狀具有治療作用，能