miR-21對人CD133-1+卵巢癌干細胞增殖、凋亡的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　上皮性卵巢癌（卵巢癌）是女性最常見的惡性腫瘤之一，其病死率高居婦科惡性腫瘤之首，由于起病隱匿、早期缺乏特異性癥狀與體征及有效的醫(yī)學(xué)篩查手段，約70％卵巢癌患者就診時已發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)的最佳時期，結(jié)果導(dǎo)致5年的總體生存率欠佳。究其原因，復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后最主要的因素。近年的研究表明，惡性腫瘤組織中存在一小群具有干細胞樣特性的細胞亞群，具有自我更新、增殖分化和侵襲轉(zhuǎn)移的能力，它們是腫瘤發(fā)生、發(fā)展

2、、侵襲和轉(zhuǎn)移的根源。如果能研究這群腫瘤細胞發(fā)生增殖、凋亡的分子機制，便可靶向性抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，從而有效防止腫瘤復(fù)發(fā)。
　　微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類長約18-25個核苷酸(nt)的單鏈非編碼小分子，它們廣泛存在于各種動植物中，通過剪切或抑制靶mRNA的翻譯，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后的負性調(diào)控。由于每個miRNA可以調(diào)控數(shù)十甚至數(shù)百個靶基因，因此，這些 miRNA幾乎對每一條信號通路都具有潛在的影響，它們廣

3、泛參與了調(diào)控人體的各種生理病理過程。越來越多證據(jù)表明，miRNA突變和異常表達與各種人體腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，miRNA可作為癌基因或抑癌基因而起作用。研究證實，miRNA能抑制或激活多種腫瘤干細胞相關(guān)基因的表達。深入研究 miRNA在腫瘤干細胞中的表達狀況及其功能，對研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機制具有重要意義，并將有利于腫瘤的診斷、預(yù)后及治療。Wang ZX等研究證實在晚期乳腺癌組織中miR-21的表達水平明顯升高，miR-21的高表

4、達是乳腺癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)，miR-21影響乳腺癌患者預(yù)后的機制目前尚不明確。人類miR-21定位于染色體17q23.2區(qū)，在乳腺癌中己證實miR-21通過抑制 Ki-67基因的表達，在結(jié)腸直腸癌細胞中 miR-21過度表達，其抑制RhoB基因表達，在惡性膠質(zhì)瘤中miR-21過多表達，下調(diào)PDCD-4基因，在宮頸癌HeLa細胞中，miR-21通過下調(diào)PDCD-4基因，通過這些途徑miR-21促進癌細胞的增殖。在膠質(zhì)瘤中，抑制

5、miR-21表達，通過激活半胱氨酸蛋白酶9和3來誘導(dǎo)瘤細胞的凋亡，在胰腺癌中，miR-21通過上調(diào)Bcl-2基因從而抑制癌細胞的凋亡。在結(jié)腸直腸癌細胞中miR-21過度表達，其抑制RhoB基因表達，通過這些從而抑制癌細胞的凋亡，但在卵巢癌腫瘤干細胞中miR-21的作用及可能的作用途徑尚不清楚。
　　研究目的：
　　本課題組前期研究中，應(yīng)用microarray芯片技術(shù)檢測了CD133/1+和CD133/1-細胞的miRNA表達

6、譜，與CD133/1-細胞相比，miR-21在CD133/1+細胞中的表達下降，本研究選取miR-21表達下降的CD133/1+細胞為研究對象，試圖探討miR-21對CD133/1+卵巢癌干細胞增殖及凋亡的作用，從而為以腫瘤干細胞為靶向的、新型的卵巢癌基因治療提供一定的實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1)流式細胞術(shù)分選CD133/1+卵巢癌干細胞：人卵巢癌細胞株OVCAR3在高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，

7、制備成單細胞懸液，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度，流式細胞術(shù)分選CD133/1+和CD133/1-細胞。
　　2)觀察成熟miR-21在CD133/1+和CD133/1-細胞的表達水平：收集上述分選的CD133/1+和CD133/1-細胞，Trizol提取總RNA，莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green染料相對實時定量測定miR-21表達水平，以U6為內(nèi)參。
　　3) MTT實驗：利用Lipofectamine2000將人

8、工合成的miR-21-mimics瞬時轉(zhuǎn)染CD133/1+細胞，并設(shè)無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組，MTT實驗檢測各轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力。
　　4) EdU實驗：利用Lipofectamine2000將人工合成的miR-21-mimics瞬時轉(zhuǎn)染CD133/1+細胞內(nèi)，并設(shè)無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用EdU試劑盒直接測定細胞內(nèi)DNA的變化快速統(tǒng)計處于S期的細胞百分數(shù)，分析細胞增殖情況。
　　5)．線粒體膜電位測定利用Lipof

9、ectamine2000將人工合成的miR-21-mimics瞬時轉(zhuǎn)染CD133/1+細胞，并設(shè)無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用羅丹明123（Rhodamine123）檢測線粒體膜電位，分析細胞凋亡情況。
　　6)．細胞凋亡檢測利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將人工合成的miR-21-mimics瞬時轉(zhuǎn)染 CD133/1+細胞，并設(shè)無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組及空白轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（Anne

10、xin V-FITC Apoptosis Detection Kit）直接測定細胞凋亡率。
　　7)統(tǒng)計學(xué)分析：計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1．在OVCAR3細胞系中CD133/1+的細胞占0.3%。
　　2．與CD133/1-細胞相比，成熟型miR-21在CD133/1+細胞中的表達明顯下降（1.00±0.00v

11、s2.16±0.25，P=0.015）。
　　3．MTT檢測顯示，在miR-21處理組中OD值明顯降低，與無關(guān)序列組及空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），無關(guān)序列組與空白對照組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　4．miR-21對CD133/1+卵巢癌干細胞增殖的影響：EdU實驗結(jié)果顯示，CD133/1+卵巢癌干細胞處于增殖期的細胞數(shù)在miR-21處理組中是48.0±5.3個，無關(guān)序列組及空白對照組增

12、殖期的細胞數(shù)分別為117±6.4個、122±4.9個。三者的增殖率分別為30.4%,47.5%,48.6%，miR-21轉(zhuǎn)染組與無關(guān)序列及空白對照組相比，miR-21處理組細胞體外增殖能力明顯下降（P<0.05），無關(guān)序列組與空白對照組相比無差異（P>0.05）。
　　5.羅丹明(Rhodamine)123熒光探針FCM分析結(jié)果證實：實驗組CD133/1+細胞線粒體膜電位相對熒光強度分別為85137±276；陰性對照組 CD133

13、/1+細胞線粒體膜電位相對熒光強度分別為98365±362；空白對照組 CD133/1+細胞線粒體膜電位相對熒光強度分別為98887±259，實驗組與空白組、陰性組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0．05)，空白組與陰性組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0．05)
　　6．Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測結(jié)果示，CD133/1+卵巢癌干細胞在miR-21處理組中的凋亡率是16.7%，無關(guān)序列組及空白對照組的凋亡率分別為9.7%，9

14、.3%，與無關(guān)序列及空白對照組相比，增加CD133/1+細胞內(nèi)miR-21的含量細胞凋亡率明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1．在卵巢癌 OVCAR3細胞系中存在少數(shù)的CD133/1+卵巢癌干細胞，成熟型miR-21在CD133/1+卵巢癌干細胞中的表達下降。
　　2．增強miR-21在CD133/1+細胞中的表達，能明顯抑制CD133/1+細胞的增殖。
　　3．增強miR-21在CD133/1+細胞中