核因子-κB p50亞基調(diào)控組織因子的機制及在動脈內(nèi)膜增生中作用的研究.pdf

1、[研究背景]：組織因子是一種含有糖基的單鏈跨膜蛋白，分子量47KD。組織因子是啟動凝血的關(guān)鍵因子，它可以同時激活凝血因子Ⅸ和X，從而啟動內(nèi)、外源性兩種凝血酶聯(lián)放大反應(yīng)，在凝血過程中起著重要作用。隨著對組織因子研究的加深，現(xiàn)在已知組織因子可以不僅作為凝血因子啟動凝血途徑，而且在動脈粥樣硬化、胚胎血管發(fā)育、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、炎癥、信號轉(zhuǎn)導中都具有重要的作用。 鑒于組織因子在多種生理和病理過程中起著重要的作用，對其表達進行調(diào)控就可以干預(yù)

2、組織因子相關(guān)疾病的病理進程，因此針對調(diào)控組織因子表達的研究具有重大的理論意義和臨床實用價值。研究表明，組織因子的表達主要在轉(zhuǎn)錄水平上受調(diào)控，它的啟動子區(qū)包含有：5個SP1、3個Egr～1、2個AP-1、1個NF-k B位點。其中SP1位點主要負責調(diào)控組織因子的本底水平的組成性表達，而Egr-1、AP-1和NF-kB位點則主要負責內(nèi)皮細胞和單核細胞中誘導性組織因子的表達。 應(yīng)用人單核細胞系THP-1細胞研究組織因子表達的研究證實，

3、存在一個56bp的增強子(-227-172)介導人組織因子的產(chǎn)生。這個啟動子含有一個NF-kB位點和兩個AP-1位點，這三個位點對誘導性組織因子的產(chǎn)生是必需的。 在以往的研究中，p65/c-Rel被認為是作用于組織因子啟動子中的NF-kB位點的主要Rel家族蛋白二聚體，但是對于p50/p65是否可以調(diào)控組織因子則沒有深入而系統(tǒng)的研究。在Rel家族蛋白形成的二聚體，含量最豐的二聚體是p50/p65，p50/p65是NF-k B信號

4、通路的主要執(zhí)行因子，所以探討其是否可以調(diào)控組織因子的表達具有理論意義和臨床應(yīng)用價值。雖然p50自身不能活化轉(zhuǎn)錄，但是p65的進核需要依賴p50，只有p50和特定的DNA靶序列結(jié)合以后，p65才能發(fā)揮其活化作用。既然p65發(fā)揮調(diào)控基因作用的前提是p50能否結(jié)合到靶DNA序列，因此探討p50是否可以與組織因子啟動子中的NF-kB位點結(jié)合就可以明確p50/p65是否可以調(diào)控組織因子的表達。 [目的]：本研究旨在探尋： (1)核

5、因子-kB p50亞基是否調(diào)控組織因子的表達； (2)核因子-k B p50亞基調(diào)控組織因子在實驗性動脈內(nèi)膜增生中的作用； (3)初步篩選靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物。 [研究方法]：本研究分為體外實驗和體內(nèi)實驗兩部分。 一.體外實驗：探尋核因子-k B p50亞基調(diào)控組織因子表達的分子機制。 (一)分離并培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞、小鼠肺靜脈內(nèi)皮細胞、人外周單核細胞及小鼠腹腔巨

6、噬細胞備用。 (二)用核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內(nèi)酯預(yù)處理人及小鼠的內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，再用脂多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細胞，然后應(yīng)用組織因子活性測定技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)檢測通過穿心蓮內(nèi)酯藥物干預(yù)或/和p50基因敲除是否可以起到下調(diào)活化的內(nèi)皮細胞和白細胞組織因子表達的作用。 (三)應(yīng)用細胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告基因?qū)嶒炓宰C明穿心蓮內(nèi)酯阻止核因子～k B p50亞基與TF-kB位點(組織因子啟動子

7、中NF-kB結(jié)合的位點)的結(jié)合，2而不是AP-1，Sp1和Egr-1位點。 (四)分別應(yīng)用電泳遷移率變動分析、染色體免疫沉淀兩種技術(shù)手段證明p50是否可以與人組織因子啟動子中的TF-KB位點結(jié)合。 (五)將人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞、小鼠肺靜脈內(nèi)皮細胞、人外周單核細胞、小鼠腹腔巨噬細胞按照5000個/孔的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板上，應(yīng)用細胞增值實驗(MTT)明確穿心蓮內(nèi)酯有無細胞毒性。 二．體內(nèi)實驗：證明核因子-k

8、B p50亞基對組織因子表達調(diào)控的功能重要性。 (一)將實驗動物進行如下分組：(1)C57鼠只進行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎而不給予任何藥物，作為正常模型組；(2)C57鼠在左側(cè)頸總動脈結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯治療，作為藥物實驗組；(3)C57鼠在動脈結(jié)扎后給予DMSO(溶解穿心蓮內(nèi)酯的溶劑)治療，作為溶劑陰性對照組；(4)C57鼠在動脈結(jié)扎后給予氫化穿心蓮內(nèi)酯(穿心蓮內(nèi)酯的非活性形式)治療，作為藥物陰性對照組；(5)C57鼠進行左側(cè)頸總動脈

9、結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯加組織因子抗體復(fù)合治療；(6)C57鼠在動脈結(jié)扎后給予組織因子抗體治療;(7)C57鼠在動脈結(jié)扎后給予IgG治療，作為組織因子抗體治療組的陰性對照組；(8)p50敲除鼠只進行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎而不給予任何藥物；(9)p50敲除鼠進行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎后給予穿心蓮內(nèi)酯治療；(10)p50敲除鼠進行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎后給予組織因子抗體治療；(11)B6野生對照鼠，該組動物只進行動脈結(jié)扎而不給予任何藥物，作為野生鼠正常模型組。

10、 (二)通過結(jié)扎實驗動物左側(cè)頸總動脈完成實驗性動脈內(nèi)膜增生的動物模型。 (三)利用H&E染色、EVG染色技術(shù)顯示血管的彈性膜，統(tǒng)計各實驗組之間增生內(nèi)膜、內(nèi)膜/中膜比值之間的差異，評價單獨或復(fù)合應(yīng)用穿心蓮內(nèi)酯治療、組織因子多克隆抗體治療、p50基因敲除在實驗性動脈內(nèi)膜增生中的作用。 (四)利用免疫組化、免疫灰度統(tǒng)計、免疫熒光共定位等技術(shù)，觀察穿心蓮內(nèi)酯治療和p50敲除對組織因子、E-selectin、VCAM-1表達

11、的影響。 (五)獲取人動脈脈管炎標本，應(yīng)用免疫組化技術(shù)了解NF-kB目標蛋白如組織因子、E-selectin、VCAM-1等和臨床疾病的相關(guān)性。 [結(jié)果]：本研究的實驗數(shù)據(jù)表明： (1)從p50敲除鼠分離的內(nèi)皮細胞和巨噬細胞活化后，組織因子的表達減少； (2)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制活化內(nèi)皮細胞和巨噬細胞組織因子的表達； (3)p50蛋白能與人組織因子啟動子中的TF-kB位點結(jié)合，穿心蓮內(nèi)酯特異性地抑制

12、p50結(jié)合到TF-k B； (4)抑制p50蛋白或敲除P50基因可以減輕動脈內(nèi)膜增生； (5)取材于本研究體內(nèi)實驗的的組織標本證明，浸潤的巨噬細胞、活化的內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞表達組織因子； (6)抑制p50蛋白或者敲除p50基因可以減少動脈內(nèi)膜增生中組織因子的表達； (7)抑制p50蛋白敲除P50基因可以下調(diào)動脈增生內(nèi)膜中E-selectin、VCAM-1的表達； (8)應(yīng)用組織因子多克隆抗體阻斷

13、組織因子的活性可以減輕動脈內(nèi)膜增生； (9)在人的動脈血栓中，NF-k B調(diào)控的目標基因也有高表達； (10)15uM穿心蓮內(nèi)酯不抑制細胞生長，無明顯的細胞毒性。 [結(jié)論]： (1)本研究首次明確地證明了核因子-k B p50亞基可以與人組織因子啟動子中的TF-kB位點結(jié)合，從而發(fā)揮對組織因子的調(diào)控作用； (2)利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灒狙芯孔C明了穿心蓮內(nèi)酯阻止了核因子-k B p50亞基與TF

14、-kB位點的結(jié)合； (3)核因子-k B p50亞基對組織因子的調(diào)控在實驗性動脈內(nèi)膜增生中起著重要的作用； (4)核因子-k B p50亞基抑制劑——穿心蓮內(nèi)酯可以顯著減緩實驗性動脈內(nèi)膜增生的進程。E-selectin、VCAM-1、組織因子的表達在穿心蓮內(nèi)酯治療鼠中均有顯著的下調(diào)； (5)靶向抑制核因子-k B p50亞基的小分子化合物穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)過進一步修飾有可能成為治療血栓和炎癥相關(guān)疾病的新藥。 總