棉花顯性無腺體基因Gl2e的克隆鑒定與作用機(jī)制分析.pdf

1、棉花是重要的戰(zhàn)略資源，也是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉纖維是紡織工業(yè)優(yōu)良的天然原料，而棉籽則是重要的營養(yǎng)資源。普通栽培棉的植株和種子都含有色素腺體，其中包含的有毒棉酚使棉籽脂肪和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分利用。但是，棉酚的毒性能幫助棉花抵抗多種病蟲害，對棉花的正常生長有重要作用。因此，選育植株有棉酚而種子無棉酚的棉花品種是低酚棉育種的主要目標(biāo)。色素腺體的數(shù)量與棉酚的含量有密切聯(lián)系，所以，克隆鑒定色素腺體發(fā)生的相關(guān)基因、探索腺體形成的分

2、子機(jī)制一直是低酚棉育種的重要研究方向。單顯性基因Gl2e可以調(diào)控?zé)o腺體性狀的形成，是低酚棉育種的重要基因資源，并且對研究色素腺體的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　本研究主要包括兩方面內(nèi)容:一是在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上對Gl2e候選基因進(jìn)行克隆和功能驗證;二是通過對7個腺體相關(guān)材料進(jìn)行小RNA測序，分析差異表達(dá)的miRNA及其靶基因，探索腺體發(fā)生過程可能涉及的miRNA和信號通路。主要結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)已有結(jié)果，Gl2e基因被精細(xì)

3、定位在12號染色體的15kb區(qū)間內(nèi)，其中只有一個預(yù)測基因。本實驗對此候選基因進(jìn)行克隆，該基因長度為1428bp，沒有內(nèi)含子，編碼475個氨基酸。該蛋白含有bHLH-MYC_N端區(qū)域(pfam14215)和bHLH保守域(pfam00010)，NCBI注釋為MYC2-LIKE蛋白，是bHLH-MYC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，我們將其命名為GhMYC2。該基因在無腺體材料中有3個堿基的變化，第128位的堿基變化導(dǎo)致了bHLH-MYC_N端區(qū)域內(nèi)的氨

4、基酸突變。GhMYC2基因在有腺體材料中表達(dá)量均高于無腺體材料。因此，GhMYC2基因很可能是控制腺體形成的基因。
　　2、GhMYC2基因啟動子序列在中12和中12顯無之間有10個堿基的差異，并且中12顯無啟動子區(qū)有兩個堿基序列缺失，分別是位于ATG上游1.5 kb和1kb“TATTACC”和“T”，但是它們并沒有影響啟動子的順式作用元件。挑選啟動子區(qū)兩段CpG島區(qū)進(jìn)行重亞硫酸鹽測序，發(fā)現(xiàn)這兩個片段在中12和中12顯無之間甲基化

5、情況沒有明顯差異，說明該基因在兩材料中的差異表達(dá)受到其他因素的調(diào)控。
　　3、亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示GhMYC2蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步證明了它是一個轉(zhuǎn)錄因子。在酵母中對GhMYC2轉(zhuǎn)錄激活活性驗證發(fā)現(xiàn)，單個氨基酸的變化對其活性有一定影響，但并沒有使其活性喪失。MYC轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域一般在N端，本實驗在酵母中證明了GhMYC2的bHLH-MYC_N區(qū)的活性與全長蛋白的活性相似，也符合植物MYC轉(zhuǎn)錄因子的特征。
　　4、G

6、hMYC2基因在有腺體中高表達(dá)而在無腺體中低表達(dá)，因此，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)沉默中12植株GhMYC2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VIGS植株上色素腺體的形成受到抑制，出現(xiàn)無腺體表型。因此，確定GhMYC2轉(zhuǎn)錄因子在腺體發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)該基因的作用，我們通過遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了RNAi轉(zhuǎn)基因植株，T0代的植株和種子都表現(xiàn)為無腺體性狀，T1代植株也表現(xiàn)為無腺體性狀，證明干擾該基因可以獲得無腺體種子，并且RNAi植株

7、的無腺體性狀可以遺傳。這是第一個克隆并驗證功能的色素腺體控制基因，為腺體發(fā)生分子機(jī)制的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。
　　5、以中12 vs中12顯無和遼7 vs遼7顯無作為顯無組合，中12 vs中12隱性無腺體（中12隱無）和中17 vs中17隱無作為隱無組合進(jìn)行小RNA分析。七個材料中共鑒定得到58個已知miRNA和109個新的miRNA(novel_1-novel_109)，在顯無組合和隱無組合中分別有10個和9個共差異表達(dá)miRN

8、A，而兩組合間共有的差異表達(dá)miRNA只有novel_14和novel_45，并且在無腺體中都下調(diào)表達(dá)。
　　6、顯無組合內(nèi)有8個差異表達(dá)miRNA預(yù)測到73個靶基因，隱無組合內(nèi)有5個差異表達(dá)miRNA預(yù)測到111個靶基因，其中novel_14和novel_45有相同的8個靶基因，除此之外，顯無和隱無組合間靶基因沒有重疊。分別對顯無和隱無組合內(nèi)靶基因進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)兩組合內(nèi)靶基因均涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬體、代謝通路和植物

9、MAPK信號通路，同時兩組合間也得到了不同的信號通路。說明顯無和隱無性狀的調(diào)控通路有重疊，也有相互獨立的部分。
　　7、從亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉中分別鑒定到14、17和34個MYC蛋白，三個棉種MYC蛋白可以劃分為三個亞家族，并且陸地棉的MYC蛋白在亞洲棉和雷蒙德氏棉中基本都能找到同源蛋白，表明MYC蛋白在棉屬分化之前已經(jīng)存在。Novel_14和novel_45的8個靶基因都屬于MYC蛋白，它們與GhMYC2進(jìn)化關(guān)系較近，并且