棉花中三個(gè)激素相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維作物和重要的油料作物之一。棉纖維是己知纖維素純度最高的天然資源之一，在世界紡織工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。棉花的生長和棉纖維的發(fā)育都離不開植物激素的調(diào)節(jié)，激素在棉花的整個(gè)生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。因此棉花中激素酶類基因的克隆既有助于植物細(xì)胞發(fā)育分子機(jī)理的闡明，也為棉纖維發(fā)育的生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。 本研究從優(yōu)質(zhì)材料7235不同棉纖維發(fā)育混合cDNA文庫中分離出三個(gè)cDNA克隆。其中一個(gè)克隆編碼腺苷高半

2、胱氨酸水解酶(命名為GhSAHH)。反義表達(dá)該基因可以增加細(xì)胞中游離的細(xì)胞分裂素的含量，誘導(dǎo)植物抗逆性防御。該cDNA克隆插入片段長度為1598bp，利用5’RACE技術(shù)得到上游318bp的片段，與原序列拼接后，得到一1916bp的cDNA序列。其開放讀碼框長度為1458bp，編碼485個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為53.2kDa，理論等電點(diǎn)為5.69，ORF上游具同框終止子。該氨基酸序列無信號肽序列，故可能是胞內(nèi)酶。BLAST‘結(jié)果

3、表明，與來源于其他植物的這類腺苷高半胱氨酸水解酶基因有較高的同源性，GhSAHH與紫花苜蓿(Medicago sativa)腺苷高半胱氨酸水解酶(GenBank登錄號：ALFMSA2S)之間一致性為83％。從表達(dá)特征上來看GhSAHH呈組成性表達(dá)，其在根、莖、葉中均有表達(dá)，而在纖維發(fā)育早期表達(dá)量較高，后期表達(dá)量逐漸降低。Southem雜交結(jié)果表明GhSAHH基因在陸地棉基因組中可能為單拷貝。利用本實(shí)驗(yàn)室陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和海島棉海

4、7124培育的140個(gè)BC<,1>作圖群體，將GhSAHH定位在染色體20上。淹水脅迫下，GhSAHH在棉花葉片中下調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)植物抗逆性防御。 第二個(gè)克隆編碼生長素應(yīng)答蛋白(命名為GhARP)。該基因編碼產(chǎn)物是生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期響應(yīng)蛋白。該cDNA克隆插入片段長度1696bp，其開放讀碼框編碼長度為1074bp，編碼357個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為38.9kDa．，理論等電點(diǎn)為6.62。該氨基酸序列無信號肽序列，故可能

5、是胞內(nèi)酶。BIAsT結(jié)果表明，與來源于其他植物的這類生長素應(yīng)答蛋白基因有較高的同源性，GhARP與葡萄(Vitis vinifera)生長素應(yīng)答蛋白(GenBank登錄號：．AY082522)之間一致性為85％。從表達(dá)特征上來看GhARP屬棉花細(xì)胞組成性表達(dá)，其在根、莖、葉及棉纖維各時(shí)期都表達(dá)量較高，看不出明顯差異。Southem．雜交結(jié)果表明GhARP基因在陸地棉基因組中可能存在多個(gè)拷貝。已將GhARP正反義片段構(gòu)建入CaMV35S的

6、植物表達(dá)載體pBIl21，正進(jìn)行棉花的轉(zhuǎn)基因研究。淹水脅迫下，GhARP在棉花葉片中表達(dá)量在脅迫后六天達(dá)最大值，隨后逐漸降低。第三個(gè)克隆編碼乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(命名為GlaEREBP)。該基因編碼產(chǎn)物是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的一個(gè)重要調(diào)控蛋白。該cDNA克隆插入片段長度1563bp，其開放讀碼框編碼長度為1191bp，編碼396個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為38．9kDa，理論等電點(diǎn)為6.62。該氨基酸序列無信號肽序列，故可能是胞內(nèi)酶。

7、BLAST結(jié)果表明，與來源于其他植物的這類乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因有較高的同源性，GhEREBP與陸地棉(Gossypium hirsutum)的乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(GenBank登錄號：AY817134)之間一致性為96％。從表達(dá)特征上來看GhEREBP屬纖維細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)，其在根、莖、葉中均有表達(dá)，而在纖維發(fā)育早期表達(dá)量較低，纖維伸長發(fā)育期表達(dá)量較高。Southem雜交結(jié)果表明GhEREBP基因在陸地棉基因組中可能存在多個(gè)拷貝。將G