棉花莖稈無腺體基因gl1的精細(xì)定位及棉酚腺體發(fā)育相關(guān)基因篩選.pdf

1、棉花不僅是世界上重要的纖維植物、油料植物，而且是僅次于大豆的重要植物蛋白源。然而，由于一般栽培棉品種的種子和植株具有棉酚腺體，其中含有對人和單胃動物有毒的棉酚及其衍生物，腺體的存在已成為棉籽開發(fā)利用的最大障礙。另一方面，棉酚作為棉花體內(nèi)一種特殊的天然保衛(wèi)素，高含量棉酚的存在對多種病原菌和害蟲有一定拮抗作用。因此，鑒定棉酚腺體關(guān)鍵控制基因、明晰棉酚腺體形成的分子機制、培育種子低酚而植株高酚的棉花品種是棉花遺傳育種長期以來的重要方向。攜帶g

2、l1基因的棉花隱性多標(biāo)記基因系T582表現(xiàn)為莖稈、葉柄和鈴殼部位無腺體，而植株其他部位都有腺體。該無腺體性狀受一對隱性基因控制。本研究通過構(gòu)建多個定位群體，結(jié)合近期公布的棉花基因組序列，開發(fā)了一批染色體特異的分子標(biāo)記，對gl1基因進(jìn)行精細(xì)定位研究，同時還利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段篩選與棉酚腺體發(fā)育密切相關(guān)的基因，主要結(jié)果如下:
　　1.我們以TM-1為母本、T582為父本構(gòu)建了一個F2陸陸群體，以3個海島棉（海7124、Pima90、3-7

3、9）為母本、T582為父本構(gòu)建3個BC1和3個F2海陸群體，并按單株自交收獲3個BC1群體的種子，種植成BC1F2群體，所有群體的總單株數(shù)達(dá)8627株。利用這些群體對gl1基因遺傳分析表明，F(xiàn)2群體的性狀分離比符合3∶1的單基因孟德爾遺傳分離比，BC1群體的性狀分離比均符合1∶1比例。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了該無腺體性狀受一對隱性基因控制。
　　2.利用兩個二倍體基因組的染色體序列開發(fā)SSR標(biāo)記。從亞洲棉基因組的13條染色體中共找到2

4、00744個SSR，從雷蒙德氏棉基因組的13條染色體中共找到142409個SSR。利用SSR側(cè)翼序列比對的方法開發(fā)染色體特異的SSR分子標(biāo)記，亞洲棉中共找到115108個染色體特異SSR，平均每條染色體含8854個;雷蒙德氏棉中共找到93780個染色體特異SSR，平均每條染色體含7213個。
　　3.四倍體棉花的兩條同源染色體（chr07和chr16）被用于檢驗所開發(fā)SSR的染色體特異性。在亞洲棉chr01（對應(yīng)四倍體的chr07

5、）和雷蒙德氏棉chr01（對應(yīng)四倍體的chr16）中分別合成了459和448個SSR。來自于亞洲棉chr01的多態(tài)性SSR僅被連鎖到chr07上，來自于雷蒙德氏棉chr01的多態(tài)性SSR僅被連鎖到chr16上，說明本次開發(fā)的SSR具有染色體特異性。
　　4.利用開發(fā)的染色體特異SSR在26條染色體上合成了1691對引物，用6個無腺體單株和6個有腺體單株對gl1基因進(jìn)行連鎖分析，得到18個與gl1基因連鎖的SSR，再結(jié)合含有113個

6、單株的BC1群體將gl1基因定位于第24號染色體上3786和3864這兩個SSR之間，區(qū)間大小為5.9cM，長約3.2Mb。同時，在該區(qū)間內(nèi)有兩個SSR標(biāo)記（4023和4101）與gl1基因完全連鎖。
　　5.在初定位的3.2Mb內(nèi)設(shè)計了100對SSR引物，將gl1基因定位到4023與4101之間，區(qū)間大小約為800kb。將此800kb內(nèi)含有86個SSR全部開發(fā)后，將gl1基因定位于3-18與3-64之間，區(qū)間大小約為420kb。

7、由于所有SSR已經(jīng)被全部開發(fā)，在此420kb內(nèi)設(shè)計了99對擴增任意序列的引物，最終將gl1基因定位于4-3與4-81這兩個標(biāo)記之間，區(qū)間大小約為330kb。本研究還使用包含約4000個單株的BC1F2群體和包含3427個單株的“TM-1×T582”F2群體試圖縮小定位區(qū)間，但僅證實了該定位區(qū)間是可靠的。
　　6、定位區(qū)間中的候選基因分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)間含有7個表達(dá)基因。這些基因的表達(dá)分析和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，它們的表達(dá)量在有腺體棉花和無

8、腺體棉花之間并無差異，而序列上存在一定的變化。我們構(gòu)建了這些基因的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)載體用于后期gl1基因的功能驗證。
　　7、利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段對5株純合顯性基因型有腺體棉花和5株純合隱性基因型無腺體棉花進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序比較，用相當(dāng)于25次重復(fù)的數(shù)據(jù)來尋找與棉酚腺體發(fā)育關(guān)系最密切的差異基因。共找到45個差異表達(dá)基因，和102個選擇性剪接差異基因，二者相互獨立，沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)基因。定位區(qū)間中的7個基因在轉(zhuǎn)錄組測序中未見差異