人可溶性BTLA酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的研制及其應(yīng)用的研究.pdf

1、共信號(hào)分子在免疫細(xì)胞上的調(diào)節(jié)性表達(dá)、相互作用及介導(dǎo)的信號(hào)參與了免疫應(yīng)答的有效啟動(dòng)、持續(xù)和適時(shí)終止。根據(jù)共信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)的不同，可以將其分成兩大超家族:免疫球蛋白（B7/CD28或Ig）超家族和腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族;此外，基于在免疫反應(yīng)中功能效應(yīng)的不同，共信號(hào)分子又可分為共刺激分子和共抑制分子。T細(xì)胞的完全活化需要共信號(hào)分子的參與，否則將導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能。BTLA(B and T lymphocyte a

2、ttenuator，BTLA)是新近發(fā)現(xiàn)的B7/CD28家族成員，與CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen4)和程序性死亡受體-1(programmed cell death1，PD-1)相似，是又—表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面的共抑制受體分子，其配體HVEM(herpesvirus entry mediator)則主要表達(dá)在免疫細(xì)胞、非淋巴組織和某些腫瘤細(xì)胞。BTLA與HVEM間相互作用介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)可以

3、阻滯細(xì)胞周期，抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增殖及IL-2等細(xì)胞因子的分泌，在參與維持外周耐受、防止機(jī)體自身免疫應(yīng)答等方面具有重要的生物學(xué)意義。然而，近期研究表明BTLA和HVEM之間有trans和cis兩種作用方式，信號(hào)傳遞也具有雙向性的特點(diǎn)，其中trans作用是BTLA作為配體向相鄰細(xì)胞上的HVEM傳遞正性信號(hào)，直接活化HVEM依賴(lài)性的NF-κB的轉(zhuǎn)錄;而同一細(xì)胞上的BTLA和HVEM之間的cis作用阻斷了trans作用對(duì)HVEM

4、的活化，從而使T細(xì)胞維持在初始狀態(tài)。
　　 許多共信號(hào)分子能分別以細(xì)胞膜型和可溶型兩種形式存在，包括OX40L、CD40L、B7-H3和PD-1等?？扇苄苑肿涌梢酝ㄟ^(guò)蛋白水解酶裂解細(xì)胞上的膜型分子而形成，也可以由免疫細(xì)胞直接分泌。許多可溶性共信號(hào)分子具有重要的臨床診斷價(jià)值，比如CTLA-4在強(qiáng)直性脊柱炎、PD-1在RA等自身免疫病患者體內(nèi)異常存在可溶性的表達(dá)形式。天然型的可溶性BTLA(sBTLA)分子在機(jī)體內(nèi)是否存在，具有何種

5、生物學(xué)功能，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮何種生物學(xué)作用，目前尚未報(bào)道。
　　 本研究構(gòu)建了用于表達(dá)人BTLA-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體，在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)和分泌，進(jìn)一步培養(yǎng)和純化獲得BTLA-Fc融合蛋白，同時(shí)將BTLA-Fc作為sBTLA替代形式研究了其在體外對(duì)T細(xì)胞的生物學(xué)作用;在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合BTLA單克隆抗體建立了特異性檢測(cè)人sBTLA的酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，并對(duì)該ELISA檢測(cè)體系進(jìn)行了分析、評(píng)價(jià);利用sBTLA的酶聯(lián)

6、檢測(cè)試劑盒對(duì)健康人和RA患者外周血中的sBTLA表達(dá)水平進(jìn)行了初步分析。
　　 一、人BTLA-Fc融合蛋白的制備及其生物學(xué)活性的研究。
　　 [目的]建立CHO/BTLA-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，使之能穩(wěn)定分泌BTLA-Fc融合蛋白。并就BTLA-Fc融合蛋白對(duì)T細(xì)胞的體外生物學(xué)作用進(jìn)行了初步研究。
　　 [方法]PCR法從本單位構(gòu)建好的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重組質(zhì)粒中擴(kuò)增人IgGl(Fc)恒定區(qū)，X

7、hoI、BamHI雙酶切后與真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP連接為重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP/Fc，同時(shí)PCR法從本單位構(gòu)建好的pEGZ-Term/BTLA重組質(zhì)粒中獲得人BTLA胞外段基因片段，用NheI、XhoI雙酶切插入上述plRES2-EGFP/Fc，構(gòu)建成重組表達(dá)載體plRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂質(zhì)體法以重組載體pIRES2-EGFP/BTLA-Fc轉(zhuǎn)染鼠CHO細(xì)胞，G418長(zhǎng)期篩選并亞克隆化。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)

8、分析BTLA-Fc融合蛋白的表達(dá)，Protein G親和層析柱對(duì)上清中的融合蛋白進(jìn)行純化，Western-blot定性分析。CCK-8檢測(cè)BTLA-Fc融合蛋白對(duì)抗人CD3單抗激發(fā)的T淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　 [結(jié)果]基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的BTLA-Fc融合蛋白能與表達(dá)BTLA配體HVEM的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/HVEM有效結(jié)合，純化的融合蛋白經(jīng)Western-blot鑒定有清晰預(yù)期目的條帶。BTLA-Fc融合

9、蛋白對(duì)T細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用。
　　 [結(jié)論]建立穩(wěn)定分泌人BTLA-Fc融合蛋白的CHO/BTLA-Fc基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，表達(dá)并分離純化獲得BTLA-Fc融合蛋白，為進(jìn)一步研制可溶性BTLA酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒奠定了抗原基礎(chǔ);該BTLA-Fc融合蛋白對(duì)T細(xì)胞體外增殖具有抑制作用。
　　 二、特異性檢測(cè)人可溶性BTLA酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的研制。
　　 [目的]研制特異性檢測(cè)人可溶性BTLA(Soluble BTLA，s

10、BTLA)的ELISA試劑盒，為定量分析不同來(lái)源的臨床標(biāo)本和研究sBTLA的功能提供有效的檢測(cè)手段，利用該ELISA試劑盒檢測(cè)不同年齡段健康人和RA患者外周血sBTLA的表達(dá)，為進(jìn)一步分析sBTLA在RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 [方法]在本單位已成功獲得的4株抗人BTLA mAb(lFll，3B6，7D7，8H9)以及一株商品化的抗人BTLA mAb(330104)的基礎(chǔ)上，用生物素標(biāo)記的lF11-bio、3

11、B6-bio、7D7-bio和8H9-bio作為檢測(cè)抗體，再與Streptavidin-HRP結(jié)合，最后用TMB作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，交叉配對(duì)獲取線(xiàn)性關(guān)系最好的一對(duì)抗體，優(yōu)化條件后建立特異性檢測(cè)人sBTLA的ELISA方法。并對(duì)該試劑盒的靈敏度和特異性進(jìn)行分析。利用上述建立的ELISA試劑盒檢測(cè)了78例健康人和60例RA患者外周血中sBTLA的表達(dá)，另外檢測(cè)了148例不同年齡段健康人外周血中sBTLA的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]8H

12、9/7D7-bio組合有良好的線(xiàn)性關(guān)系，優(yōu)化條件后成功研制出檢測(cè)人sBTLA的ELISA試劑盒，其能特異性應(yīng)用于檢測(cè)人sBTLA蛋白，而與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。試劑盒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在抗原濃度為0.31～20 ng/ml范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，并具有良好的準(zhǔn)確性和特異性。利用該檢測(cè)試劑盒對(duì)RA患者及不同年齡段健康人外周血中sBTLA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析顯示，RA患者血清中sBTLA的含量較健康人顯著增高，健康人血清中sBTLA的含量隨著年

13、齡段的增加也顯著增高。
　　 [結(jié)論]研制成功特異性檢測(cè)人sBTLA的試劑盒，為定量分析sBTLA蛋白因子提供了有效的檢測(cè)手段。與健康對(duì)照組相比，RA患者外周血sBTLA的表達(dá)水平明顯增高，健康人隨著年齡段的增加其血清中sBTLA的含量也顯著增高。
　　 綜上所述，本課題成功構(gòu)建了用于表達(dá)人BTLA-Fc融合蛋白的真核表達(dá)載體，在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)分泌，純化獲得BTLA-Fc融合蛋白;在此基礎(chǔ)上，建立了特異性檢測(cè)