人CD7 cDNA的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、為獲得充足的CD7材料來源,以制備抗CD7基因工程抗體并研究CD7的作用機(jī)制,該文進(jìn)行了以下工作:(1)人CD7膜外區(qū)cDNA在大腸桿菌中的表達(dá),并對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行了純化.(2)人CD7在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)并對(duì)其在LPS信號(hào)傳遞及細(xì)胞凋亡中的作用進(jìn)行探討.主要研究內(nèi)容及結(jié)果:1.CD7膜外區(qū)cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)及重組融合蛋白的純化;(1)通過PCR調(diào)整CD7膜外區(qū)cDNA的閱讀框架,使之與生物素化蛋白基因的閱讀框架一致.缺失了

2、編碼CD7信號(hào)肽的核甘酸序列,并增加了一個(gè)大腸桿菌偏性終止密碼子.(2)將陽性重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α,用IPTG誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá).2.人CD7在哺乳類細(xì)胞中的表達(dá)及其功能探討;(1)根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫中人CD7 cDNA序列,設(shè)計(jì)并合成一段引物,通過PCR法從含CD7的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到了CD7全長cDNA,擴(kuò)增片段經(jīng)XhoI、XbaI酶切后,同經(jīng)相同酶切的線性化質(zhì)粒pcIneo、pcDNA3連接構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體p

3、cIneo-CD7、pcDNA3-CD7. (2)通過電穿孔和磷酸鈣法將重組質(zhì)粒pcDNA3-CD7和空質(zhì)粒pcDNA3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞,在有G418的條件下培養(yǎng)2~3周,篩選出G418抗性克隆,用RT-PCR和FCM對(duì)G418抗性克隆細(xì)胞進(jìn)行分析.(3)LPS分別刺激HEK293/CD7細(xì)胞和HEK293后,用夾心ABC-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-8含量.(4)PHA分別刺激CD7<'+>Jurkat和CD