CRH和皮質(zhì)酮影響小鼠著床前胚胎發(fā)育的機(jī)制：體外模型研究.pdf

1、心理應(yīng)激時(shí)機(jī)體激活下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，從不同水平對(duì)雌性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生多層次的抑制作用。HPA軸的主要中樞調(diào)節(jié)因子是CRH和精氨酸加壓素（AVP），兩者協(xié)同作用于垂體前葉促進(jìn)ACTH和其他阿黑皮素原（POMC）衍生肽（如β-內(nèi)啡肽）分泌，隨后ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)促進(jìn)腎上腺合成并釋放糖皮質(zhì)激素（GCs）。CRH和其誘導(dǎo)產(chǎn)生的β-內(nèi)啡肽抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）分泌，腎上腺皮質(zhì)分泌的GCs則抑制促黃體激素（LH）和卵巢

2、中雌二醇、孕酮的產(chǎn)生，使靶組織或器官對(duì)雌二醇產(chǎn)生抗性。因此，應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的CRH和GCs對(duì)雌性生殖系統(tǒng)的不利影響是非常明顯的。本實(shí)驗(yàn)室前期研究認(rèn)為，小鼠合子形成初期束縛應(yīng)激48 h，可使胚胎發(fā)育能力明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致妊娠率降低，然而有關(guān)其作用機(jī)理并不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)選取CRH和GCs，通過(guò)體外直接添加或與小鼠輸卵管上皮細(xì)胞（OECs）共培養(yǎng)或制取條件化培養(yǎng)液（CM）培養(yǎng)小鼠原核胚，探索CRH和GCs對(duì)著床前胚胎發(fā)育的影響，并對(duì)其作用

3、機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　結(jié)果表明：
　　（1）培養(yǎng)液中直接添加CRH不會(huì)損傷著床前胚胎發(fā)育（P＞0.05），但與OECs共培養(yǎng)時(shí)添加CRH能明顯降低原核胚發(fā)育至囊胚的比例（P＜0.05）。利用WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠OECs表達(dá)CRHR蛋白，且CRH促進(jìn)其表達(dá)（P＜0.05）；利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)早期胚胎（囊胚階段除外）都不表達(dá)CRHR蛋白，這說(shuō)明CRH通過(guò)與OECs中CRHR結(jié)合，對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育產(chǎn)生不利作用。對(duì)OE

4、Cs氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CRH造成細(xì)胞內(nèi)GSH還原能力下降（P＜0.05），過(guò)氧化物TOS水平以及OSI值升高（P＜0.05），清除過(guò)氧化物的還原酶如SOD酶水平降低（P＜0.05）、但過(guò)氧化氫酶水平升高（P＜0.05），分泌的促胚胎發(fā)育生長(zhǎng)因子水平降低（P＜0.05），說(shuō)明CRH誘導(dǎo)OECs發(fā)生氧化應(yīng)激。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OECs表達(dá)Fas水平升高（P＜0.05），培養(yǎng)液中FasL水平升高（P＜0.05），說(shuō)明OECs啟動(dòng)死亡受體途徑

5、，進(jìn)而檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)Caspase-3水平升高（P＜0.05），細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡的比例明顯升高（P＜0.05）。
　?。?）培養(yǎng)液中直接添加GCs不會(huì)損傷著床前胚胎發(fā)育（P＞0.05），但與OECs共培養(yǎng)時(shí)添加GCs能顯著降低原核胚發(fā)育至囊胚的比例（P＜0.05）。利用WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠OECs表達(dá)GR蛋白，且GCs下調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）；利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段早期胚胎都表達(dá)GR蛋白。接著我們利用熒光定量RT-

6、PCR檢測(cè)早期胚胎，沒(méi)檢測(cè)到11-HSD1 mRNA表達(dá)，但GCs上調(diào)11-HSD2 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。因此，GCs可能通過(guò)11-HSD2解除對(duì)早期胚胎發(fā)育的直接阻礙作用，但可能通過(guò)與OECs中GR結(jié)合對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利作用。對(duì)OECs氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GCs造成細(xì)胞內(nèi)GSH還原能力下降（P＜0.05），過(guò)氧化物TOS水平以及OSI值升高（P＜0.05），清除過(guò)氧化物的還原酶如SOD酶水平降低（P＜0.05）、過(guò)氧化

7、氫酶等水平升高（P＜0.05），分泌的促胚胎發(fā)育生長(zhǎng)因子水平降低（P＜0.05），說(shuō)明GCs誘導(dǎo)OECs發(fā)生氧化應(yīng)激。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OECs表達(dá)Fas水平升高（P＜0.05），培養(yǎng)液中FasL水平升高（P＜0.05），說(shuō)明OECs啟動(dòng)死亡受體途徑，進(jìn)而檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)Caspase-3水平升高（P＜0.05），細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡的比例明顯升高（P＜0.05）。
　　總之，CRH或GCs通過(guò)與OECs中各自的受體結(jié)合，導(dǎo)致OECs發(fā)生