膠質(zhì)瘤細胞在緩激肽選擇性開放血腫瘤屏障中的作用探討.pdf

1、前期的離體實驗顯示，緩激肽(bradykinin，BK)可以觸發(fā)膠質(zhì)瘤細胞及星形膠質(zhì)細胞內(nèi)鈣離子水平升高，并且BK生理刺激濃度下不能引起原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞(BrainMicrovascularEndothelialCells，BMECs)的細胞內(nèi)鈣離子升高，提示BMECs不是小劑量BK的直接作用靶點。因此推測在體狀態(tài)下，小劑量BK的直接作用靶點是膠質(zhì)瘤細胞，BK刺激后產(chǎn)生的一些細胞間信使可能在BK間接調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細胞通透性中起到

2、關(guān)鍵作用：BKB2受體在膠質(zhì)瘤細胞上大量表達，B2受體是和G蛋白偶連的跨膜蛋白，當(dāng)BK和其結(jié)合后能增加細胞外Ca2+向細胞內(nèi)的流入，引起細胞內(nèi)的鈣離子升高，細胞內(nèi)鈣離子的升高可以導(dǎo)致鈣離子依賴性NOS活化，產(chǎn)生高濃度的一氧化氮(NitricOxide，NO)，作為游離氣體存在的NO是一種理想的細胞間信使，結(jié)合在體研究中NOS抑制劑可以明顯抑制BK增加血腫瘤屏障通透性的研究結(jié)果。我們認(rèn)為BK調(diào)節(jié)腦血管內(nèi)皮細胞屏障功能的內(nèi)在機制很可能是BK

3、刺激后在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生NO，NO可以從腫瘤細胞彌散到內(nèi)皮細胞，啟動內(nèi)皮細胞的“NOcGMP↑—通透性↑”這一級聯(lián)反應(yīng)。本研究中，我們將對BK刺激后腫瘤細胞內(nèi)的NO進行動態(tài)實時研究，并在離體Transwell血腫瘤屏障(BloodTumorBarrier,BTB)模型下研究BK調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細胞對大分子物質(zhì)的通透性以及NO在細胞間傳遞的可能性。 在研究BK觸發(fā)細胞內(nèi)鈣離子升高過程中我們發(fā)現(xiàn)，BK作用后大鼠原代星形膠質(zhì)細胞和C6膠

4、質(zhì)瘤細胞的反應(yīng)方式不同：10-5MBK作用于C6膠質(zhì)瘤細胞后，存在較長的(＞30s)鈣離子波峰的升高期；高峰后存在明顯的平臺持續(xù)期；二次高峰多見；50％的鈣離子升高持續(xù)時間較長(＞50s)。10-5MBK的重復(fù)刺激，不能產(chǎn)生上述寬廣的鈣離子高峰，重復(fù)刺激后產(chǎn)生的鈣離子升高模式同10-4MBK作用于星形膠質(zhì)細胞類似，細胞內(nèi)的鈣離子在10～20s后形成一個高峰，很少出現(xiàn)二次鈣峰，我們初步考慮此種差別可能與細胞內(nèi)鈣庫的釋放相關(guān)。為進一步明確鈣

5、離子升高模式的差別及其意義，我們對細胞外鈣內(nèi)流與細胞內(nèi)鈣庫釋放之間的關(guān)系進行了深入探討；在10-7～10-3M范圍下，對BK引起膠質(zhì)瘤細胞、星形膠質(zhì)細胞及腦微血管內(nèi)皮細胞(BrainMicrovascularEndothelialCells，BMECs)的反應(yīng)進行了探討。 材料和方法： 腦微血管內(nèi)皮細胞及星形膠質(zhì)細胞來自Wistar胎大鼠的原代培養(yǎng)，大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞來自中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室。 1、單一細

6、胞的細胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)測定將準(zhǔn)備好的細胞在37℃下，用鈣熒光探針Fluo-3/AM(終濃度：10μM)避光孵育約30min。實驗采用細胞內(nèi)鈣離子熒光成像測試系統(tǒng)(MetaFluor4.5，USA)。實時測定BK刺激前后單一細胞的細胞內(nèi)鈣離子的變化。 配置終濃度為10-7M，10-6M，10-5M，10-4M，10-3M的緩激肽，對不同濃度緩激肽作用后大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞和星形膠質(zhì)細胞的鈣離子升高模式進行比較分析。 2、單一

7、細胞的細胞內(nèi)NitricOxide的動態(tài)測定準(zhǔn)備好測試細胞，避光條件下將DAF-2/DA混于細胞外液中，終濃度為10μM，孵育30min后取出，再用緩沖液沖洗兩遍除去胞外多余DAF-2/DA后即可開始實驗，測定細胞內(nèi)熒光強度的激發(fā)波長為490nm、發(fā)射波長520am。掃描記錄細胞內(nèi)熒光強度，每10秒掃描1次，共20min，測定不同組別、不同干預(yù)因素下細胞內(nèi)NitricOxide的動態(tài)變化，采用iNOS選擇性抑制劑氨基胍、nNOS選擇性抑

8、制劑7-NI，判定參與緩激肽作用后信號傳遞的NOS類型。 通過BMECs與C6膠質(zhì)瘤細胞的共浴培養(yǎng)探討NitricOxide可能的細胞間傳遞功能，證明NitricOxide細胞間信使作用。 3、Transwell體外血腫瘤屏障模型的建立及通透性測定采用Transwell多聚酯膜建立體外血腫瘤(BloodTumorBarrier,BTB)屏障模型，首先接種大鼠膠質(zhì)瘤C6細胞于Transwell底面，24h后接種BMECs(

9、第二代)于Transwell的上面，鏡下觀察BMECs成片融合后，選取4h測漏試驗陽性的TranswellBTB模型，行大分子物質(zhì)-辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)的通透性測定。 設(shè)定BTB對照組、BTBBK實驗組、BTBnNOS抑制劑7-NI+BK實驗組、單層BMECs+BK實驗組。 結(jié)果： 1、不同劑量緩激肽作用下細胞內(nèi)鈣離子升高模式及其意義細胞外鈣離子是BK作用后在C6膠

10、質(zhì)瘤細胞內(nèi)形成峰式升高的前提條件：在細胞外無鈣離子條件下，細胞中心部位的熒光在BK刺激后3min內(nèi)出現(xiàn)緩慢增強，這說明BK可以觸發(fā)細胞內(nèi)鈣庫的緩慢釋放，但是這種作用反應(yīng)時間較長、幅度小。對細胞膜周及細胞中心部位熒光的進一步分析證明，在細胞外鈣離子存在的條件下，BK刺激后可以觸發(fā)明顯的鈣離子內(nèi)流，并且鈣離子內(nèi)流后存在一個5～15s的延遲性鈣離子釋放過程，我們初步認(rèn)為這可能是細胞內(nèi)鈣庫釋放所致，分析證明這部分鈣離子釋放參與BK刺激后鈣離子高

11、峰后平臺期、二次高峰以及寬廣鈣離子升高峰的構(gòu)成。進一步用尼諾丁(Ryanodine)來阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ryanodine敏感受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣庫釋放后，可以完全消除BK刺激后峰后平臺期、二次高峰以及寬廣鈣離子升高峰。上述實驗表明緩激肽作用后可以觸發(fā)細胞外鈣離子內(nèi)流誘發(fā)的鈣釋放(Calciuminducedcalciumrelease，CICR)，為探討B(tài)K觸發(fā)后的CICR是腫瘤特異性的還是BK濃度依賴性的?我們對10-7M～10-3M下BK

12、作用于大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞、星形膠質(zhì)細胞以及BMECs后的細胞內(nèi)鈣離子升高模式進行了對比研究：大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞的BK反應(yīng)區(qū)間為10-7M～10-3M，隨BK濃度的增加，細胞出現(xiàn)鈣離子升高以及CICR的發(fā)生明顯增加，而在星形膠質(zhì)細胞中，BK有效作用濃度為10-4M～10-3M，大劑量BK(10。M)也可以觸發(fā)星形膠質(zhì)細胞的CICR，但在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)CICR發(fā)生比率較C6膠質(zhì)瘤細胞顯著偏低，兩者之間有顯著差異。 10-5MBK刺激

13、后，不同于立即觸發(fā)的細胞內(nèi)鈣離子升高峰，大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)NO出現(xiàn)持續(xù)升高，采用Ryanodine來阻斷BK刺激后細胞內(nèi)的CICR后，可以明顯降低BK作用后細胞內(nèi)NO的持續(xù)升高過程，說明細胞內(nèi)NO的產(chǎn)生繼發(fā)于BK刺激后的CICR，nNOS選擇性抑制劑7-NI可以明顯抑制BK刺激后的NO產(chǎn)生，提示nNOS參與BK作用后的細胞內(nèi)NO釋放過程。 同時我們證明：BK刺激后大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的NO可以發(fā)生細胞間傳遞，體外情況下存在N

14、O從C6膠質(zhì)瘤細胞到鄰近BMECs間的傳遞過程，提示BK可以通過NO來間接調(diào)節(jié)BMECs的血腦屏障特性。膠質(zhì)瘤細胞與BMECs的共同培養(yǎng)的細胞內(nèi)熒光實驗顯示，膠質(zhì)瘤細胞及其微環(huán)境不能增加BMECs對BK的敏感性，提示在體狀態(tài)下，膠質(zhì)瘤周微血管內(nèi)皮細胞亦不是緩激肽的直接作用靶點。 2、BK調(diào)節(jié)Transwell血腫瘤屏障模型通透率在BTB血腫瘤屏障模型上，10-5MBK可以顯著增加腦微血管內(nèi)皮細胞對辣根過氧化物酶(HRP)的通透作

15、用，10min內(nèi)對HRP的通透率最高，并且nNOS抑制劑7-NI可以顯著減低BK對HRP的通透作用，提示BK刺激后，大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生的NO可能啟動某些下游因子，最終引起B(yǎng)MECs的血腦屏障開放。另外10-5MBK不能增加單層腦微血管內(nèi)皮細胞對辣根過氧化物酶的通透作用，進一步提示原代培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細胞不是BK的直接作用靶點，膠質(zhì)瘤細胞在BK調(diào)節(jié)血腫瘤屏障中起關(guān)鍵啟動作用。 結(jié)論： 1、C6膠質(zhì)瘤細胞、星形膠質(zhì)細胞

16、上存在功能性的Ryanodine敏感受體，緩激肽作用后，細胞外鈣內(nèi)流可以觸發(fā)Ryanodine介導(dǎo)的細胞鈣內(nèi)庫釋放，即鈣離子內(nèi)流誘發(fā)的鈣釋放(CalciuminducedCalciumRelease，CICR)。2、緩激肽作用后出現(xiàn)細胞內(nèi)的NitricOxide持續(xù)升高過程，細胞內(nèi)NitricOxide的持續(xù)升高繼發(fā)于細胞內(nèi)的CICR。 3、大鼠星形膠質(zhì)細胞和C6膠質(zhì)瘤細胞在緩激肽刺激下CICR反應(yīng)性的不同可能是小劑量緩激肽選擇