腫瘤多藥耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜和人細(xì)胞色素氧化酶CYP2C19檢測芯片的初步研究和應(yīng)用.pdf

1、基因芯片的分類有許多不同的方法，根據(jù)探針的來源、長短和制作方法可分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片兩類。 cDNA芯片是一種獲得基因功能信息的高通量的方法，可用于表達(dá)差異的檢測，cDNA芯片直接利用cDNA克隆庫制備芯片，通過點(diǎn)樣儀在一塊顯微鏡載玻片上點(diǎn)上幾百至幾千個固定的DNA探針，以類似于Northernb1ot和Southernblot的方法進(jìn)行雜交。 寡核苷酸芯片的制作技術(shù)有多種，其中有兩種最具代表性，一種以Affy

2、metrix司的光控合成為代表；另一種是合成后再交聯(lián)到基質(zhì)上的方法，與cDNA芯片的制作類似。 兩種芯片的技術(shù)過程均包括4個步驟：1.DNA方陣的構(gòu)建；2.樣品DNA或mRNA的準(zhǔn)備；3.分子雜交；4.雜交圖譜的檢測和分析。 由于受價格、芯片制作技術(shù)、可靠性等因素的影響，限制了基因芯片的實(shí)際應(yīng)用和推廣。因此本研究以玻片為基質(zhì)，以兩種芯片的制備、優(yōu)化研究為重點(diǎn)，并在端粒酶、腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性相關(guān)基因、細(xì)胞色素氧化酶2D6C

3、(CYP2D6C)和2C19(CYP2C19)SNP芯片檢測等方面進(jìn)行了初步應(yīng)用研究，為以后芯片在相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。 在第一部分研究中，主要研究內(nèi)容包括：一.cDNA芯片的制備、優(yōu)化及端粒酶的芯片檢測在這部分研究中，重點(diǎn)研究了影響芯片固化效率的各種因素。研究發(fā)現(xiàn)醛基化玻片具有固化效率高、背景低的特點(diǎn)，適用于研究；固化效率受多種因素影響，這些因素包括：探針5’端氨基修飾、探針長度、點(diǎn)樣液、探針濃度、雜交溫度、雜交時間及紫外交

4、聯(lián)等，實(shí)驗(yàn)中分別進(jìn)行了優(yōu)化；在端粒酶的芯片檢測中，首先克隆了β-actin作為管家基因，6種常見腫瘤紐胞的端粒酶芯片檢測結(jié)果顯示MCF-7和HT-2細(xì)胞株的端粒酶基因表達(dá)量較高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步測定了大腸癌患者的臨床標(biāo)本，12個標(biāo)本中，有11個表達(dá)量增高。 二.腫瘤多藥耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片初步研究在此部分研究中，通過LY980503對MCF/DOX作用表達(dá)譜的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：320個基因中有8個基因有變化，其中7個基因表達(dá)降低

5、，這7個基因包括：癌基因3個(V-raf，LLGL，ankyrinmotif)，酪氨酸激酶基因2個(Argproteintyrosinekinase-bindingprotein，F(xiàn)ms-relatedproteintyrosinekinase33)，熱休克蛋白基因1個(90-kDaheat-shockproteingene)，環(huán)氧化酶基因1個(COX8)增強(qiáng)的1個基因是分化相關(guān)基因(RTP)。 在第二部分研究中，主要研究內(nèi)容包

6、括： 一.SNP寡核苷酸檢測芯片制備方法的優(yōu)化首先合成了具有高固化效率的Dendrimer玻片；探針5’端經(jīng)過氨基修飾不能提高固化效率，但可提高雜交效率；間隔臂的長度對雜交效率有影響，以15個t為最佳；突變檢測點(diǎn)位于探針中間；優(yōu)化了探針的長度，以15mer分辨率最高。 二.細(xì)胞色素氧化酶2D6C(CYP2D6C)檢測芯片的研制根據(jù)Genbank設(shè)計(jì)了檢測CYP2D6C缺失突變的檢測探針，對人工合成靶進(jìn)行了檢測，能明顯區(qū)分