先天性特異性眼球震顫相關(guān)FRMD7蛋白在神經(jīng)元發(fā)育中的作用及其信號(hào)通路研究.pdf

1、先天性特異性眼球震顫(idiopathic congenital.Nystagmus，ICN)是一種以發(fā)作性有節(jié)律的雙側(cè)眼球擺動(dòng)為典型癥狀的遺傳性異質(zhì)性疾病，其中以女性X連鎖不完全顯性遺傳最為常見。該病多在出生時(shí)及出生后六個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)癥狀，可持續(xù)終身，患者可伴有不同程度的視力下降，部分患者通過代償頭位來減輕眼球震顫的幅度和強(qiáng)度以提高視力，明顯影響生活質(zhì)量，目前尚無有效的治療方法。
　　2006年，Tarpey等首先克隆了X連鎖ICN

2、的致病基因-即酵母功能域包含蛋白7（ferm domain containing protein7，F(xiàn)RMD7）(NM_194277)。繼之，研究者對(duì)不同種族的家系及散發(fā)病例進(jìn)行FRMD7基因突變分析，目前已發(fā)現(xiàn)FRMD7的突變位點(diǎn)40多個(gè)。2007年，我們對(duì)收集的X連鎖ICN家系進(jìn)行突變檢測，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)國際上新的錯(cuò)義突變(c.781C＞G and c.886G＞C)（國際突變數(shù)據(jù)庫收錄，分別命名為:HM070040及HM070041）

3、和一個(gè)已報(bào)道的無義突變(c.1003C＞T)，進(jìn)一步確定了FRMD7基因在ICN發(fā)病機(jī)制中的重要性。
　　FRMD7蛋白是4.1超家族蛋白的成員之一，編碼714個(gè)氨基酸，其中含有一個(gè)與band4.1、Ezrin、Moesin、Radixin、Talin、Filopodin等一樣的FERM結(jié)構(gòu)域，約包含300個(gè)氨基酸，多位于蛋白的N端。有研究認(rèn)為FERM結(jié)構(gòu)域可能與通過膜相關(guān)蛋白（如Hyaluronan受體CD44，肌動(dòng)蛋白骨架蛋白

4、等）調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附和形態(tài)有關(guān)，因此推測FRMD7可能與從包膜受體到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。近年來Betts-Henderson等研究發(fā)現(xiàn)FRMD7蛋白在神經(jīng)元的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，該作用可能與細(xì)胞骨架F-actin的調(diào)節(jié)相關(guān)。然而，F(xiàn)RMD7的確切功能及其在ICN發(fā)病機(jī)制中的作用仍不清楚。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元的生長發(fā)育過程中，F(xiàn)RMD7蛋白的同源蛋白（FARP1和FARP2）均起著重要作用。而FARP1和FA

5、RP2調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長發(fā)育均與激活Rho GTPases相關(guān);另外早有研究發(fā)現(xiàn)FERM家族蛋白Ezrin/Radixin/Moesin可與Rho GDP分離抑制分子結(jié)合從而激活Rho GTPases。Rho GTPases（Rac1，RhoA和Cdc42）是真核細(xì)胞形態(tài)改變中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，參與神經(jīng)元的發(fā)育與塑形，如神經(jīng)突的生長，軸突的指導(dǎo)及樹突修飾等過程。其功能上起著分子開關(guān)的作用，循環(huán)于兩種狀態(tài)之間，即激活的GTP狀態(tài)

6、和失活的GDP狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)均提示FRMD7調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)育可能也與Rho GTPases相關(guān)。
　　因此在前期研究的基礎(chǔ)上，我們對(duì)FRMD7基因的功能及其在調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育中的作用通路做了一系列的探索，本研究得到的結(jié)果如下:
　　1.免疫組化示在孕16-17周，F(xiàn)RMD7蛋白在腦干（中腦，延髓，腦橋）高表達(dá)，這與控制眼球運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)核團(tuán)主要位于腦干相一致。同時(shí)，此階段FRMD7蛋白在小腦及間腦亦有表達(dá)。在后期（孕21周及25周

7、），F(xiàn)RMD7在腦干的表達(dá)量明顯下降，在小腦及間腦基本無表達(dá)。在皮質(zhì)，僅檢測到在皮質(zhì)下層有少量表達(dá)。
　　2.細(xì)胞亞定位研究顯示表達(dá)FERM-EGFP和FERM+FA-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，而表達(dá)N端FERM或FERM+FA截短的△FERM-EGFP和△FERM+FA-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光則主要分布于胞漿，但表達(dá)比全長有所減弱;說明FRMD7的出核序列NES位于C端;
　　3.與細(xì)胞亞定位結(jié)

8、果一致，野生型FRMD7質(zhì)粒，突變型C781G和G886C質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而表達(dá)突變型C1003T質(zhì)粒（C端截短）的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。同時(shí)野生型FRMD7和突變型C781G，G886C均與F-actin有共定位，且無明顯區(qū)別。由于突變型C1003T導(dǎo)致了C端的截短蛋白，細(xì)胞定位發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致其與F-actin無共定位;
　　4.在經(jīng)維甲酸RA低血清誘導(dǎo)3天后過表達(dá)小鼠FRMD7蛋白的N

9、euro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起的長度較對(duì)照組伸長(對(duì)照組=68.99±2.59，F(xiàn)RMD7組=94.40±2.62，P＜0.01)，分化為神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組無明顯區(qū)別（對(duì)照組38.63±3.65，F(xiàn)RMD7組41.87±3.46）;
　　5.在過表達(dá)FRMD7蛋白后48小時(shí)，神經(jīng)元特異性骨架相關(guān)蛋白基因，如微管相關(guān)蛋白Mtap2，低分子量和中分子量神經(jīng)纖維絲(NF-L，NF-M)，微管相關(guān)Tau蛋白及神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN m

10、RNA表達(dá)均顯著升高，而其他相關(guān)神經(jīng)元特異性基因則無明顯變化;
　　6.免疫共沉淀證實(shí)小鼠FRMD7與mRho GDIα存在相互作用，且GST pull down實(shí)驗(yàn)顯示僅全長存在這種相互作用，無論mFRMD7 N端或者C端單獨(dú)都不能與mRho GDIα相互作用;
　　7.GST pull down結(jié)果顯示mFRMD7真核表達(dá)質(zhì)粒與Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶Rho GTPases表達(dá)質(zhì)粒(Rac1，Cdc42和RhoA)共

11、轉(zhuǎn)Neuro-2a細(xì)胞后，Rac1/Cdc42的下游效應(yīng)因子GST-PAK2融合蛋白捕獲激活Rac1-GTP蛋白的量明顯大于對(duì)照組，而Cdc42與RhoA兩組則與對(duì)照組無明顯區(qū)別;
　　8.Myc標(biāo)簽的Rho分離抑制分子GDI真核表達(dá)質(zhì)粒與mFRMD7野生型質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)Neuro-2a細(xì)胞，anti-Myc印跡后，Western Blot檢測anti-Rac1的表達(dá)較Rho分離抑制分子GDI真核表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染組減少;
　　

12、9.細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)顯示在NIH3T3細(xì)胞過表達(dá)FRMD7，可引起細(xì)胞形態(tài)變化，并出現(xiàn)膜皺褶及板狀偽足，即Rac1激活表型;
　　10.GST pull down提示hFRMD7真核表達(dá)質(zhì)粒及其突變型與Rac1表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞后，突變型組GST-PAK2融合蛋白捕獲激活Rac1-GTP蛋白的量明顯小于對(duì)照組（野生型）;特別是突變型C1003T組，GST-PAK2融合蛋白幾乎未捕獲激活的Rac1-GTP蛋白;
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13、1.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)揭示hFRMD7野生型及其突變型與Myc-Rho GDIα共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，anti-Myc印跡后，突變型與Rho GDIα的相互作用與野生型相比明顯減弱，同時(shí)從Rac1-Rho GDIα復(fù)合物中釋放的Rac1的量明顯減少;尤C端截短的C1003T突變型，幾乎不能與Rho GDIα相互作用，從而不能釋放Rac1。
　　綜上所述，F(xiàn)RMD7蛋白可能在胎兒腦干的早期發(fā)育階段發(fā)揮作用，且突變型FRMD7蛋白導(dǎo)致I

14、CN的機(jī)制可能與F-actin相關(guān);FRMD7蛋白可促進(jìn)分化Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)元突起的生長，該作用不僅跟F-actin有關(guān)，同時(shí)也與影響中間神經(jīng)纖維絲及微管蛋白的動(dòng)力相關(guān)。FRMD7能與Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶Rho GTPases主要調(diào)節(jié)者之一Rho GDIα相互作用，且該作用需要其氨基端(N端)和羧基端（C端）同時(shí)存在，其C端也是FRMD7蛋白的出核序列NES所在;同時(shí)FRMD7蛋白與Rho GDIα相互作用后能從Rac1