HLA單倍體相合造血干細(xì)胞移植治療Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的臨床初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　 Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）是一種X連鎖隱性遺傳性致死性疾病，以進(jìn)行性四肢近端骨骼肌萎縮無(wú)力、小腿腓腸肌假性肥大為特征，是最常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉疾病，發(fā)病率為1/3500男嬰。
　　 定位于X染色體短臂(Xp21.1-21.3)上的抗肌萎縮蛋白（Dystrophin，Dys）基因（即DMD基因）突變是本病致病的根本原因，其編碼427KD的

2、細(xì)胞骨架蛋白即抗肌萎縮蛋白(dystrophin)?？辜∥s蛋白可維系和保持肌纖維膜的穩(wěn)定，可防止肌肉收縮時(shí)的各種機(jī)械因素的損傷。DMD基因發(fā)生的無(wú)義突變、移碼突變等導(dǎo)致患者肌肉中抗肌萎縮蛋白完全缺乏或者產(chǎn)生截短的無(wú)功能的蛋白，導(dǎo)致肌纖維逐漸變性、壞死等DMD具有診斷意義的特征性病理表現(xiàn)。
　　 DMD患兒雖然在新生兒期就出現(xiàn)肌纖維壞死及血清CK升高，但早期肌肉無(wú)力的癥狀常未引起重視，直到2～3歲左右才被發(fā)現(xiàn)。確診指標(biāo)包括DNA

3、遺傳學(xué)分析和（或）抗肌萎縮蛋白檢測(cè)。3～5歲左右患者出現(xiàn)典型的鴨步步態(tài)，起立及上樓梯困難。隨后出現(xiàn)腓腸肌假性肥大、四肢近端肌肉無(wú)力，Gowers征陽(yáng)性。疾病進(jìn)展導(dǎo)致的脊柱前凸使患者生活依賴輪椅。進(jìn)行性的肌肉衰退導(dǎo)致患者在9～13歲喪失行走能力，且呼吸肌、心肌逐漸累及。20歲左右因呼吸肌、心肌萎縮、無(wú)力，呼吸和（或）循環(huán)衰竭而死亡。
　　 盡管明確DMD疾病基因及病理基礎(chǔ)已有20余年，但尚無(wú)有效阻止病情不可逆性惡化和治愈的方法。藥

4、物治療、成肌細(xì)胞移植治療(MyoblastTransplantation Therapy, MTT)效果欠佳，基因治療和iPS細(xì)胞(induced pluripotentstem cells)治療存在導(dǎo)致細(xì)胞突變、原癌基因激活的風(fēng)險(xiǎn)。DMD不僅使得患者幼小心靈遭受疾病折磨，更給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和身心負(fù)擔(dān)。
　　 干細(xì)胞的橫向分化理論為造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem celltransplantati

5、on，HSCT)治療DMD提供了理論基礎(chǔ)。1999年Gussoni等證實(shí)了骨髓造血干細(xì)胞、全骨髓細(xì)胞均具有向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能，2000年，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科DMD研究課題組觀察到經(jīng)骨髓干細(xì)胞移植治療的mdx鼠運(yùn)動(dòng)功能及生命期限明顯優(yōu)于對(duì)照組，肌肉活檢證實(shí)抗肌萎縮蛋白表達(dá)。2002年Gussoni等報(bào)道1例1歲時(shí)由于嚴(yán)重的X連鎖聯(lián)合免疫缺陷而接受骨髓移植并在12歲時(shí)被確診為DMD的患者，該患者DMD惡性進(jìn)程明顯得到遏制，肌肉活檢發(fā)

6、現(xiàn)了有供者來(lái)源的肌肉細(xì)胞，證實(shí)外源性人類造血干細(xì)胞具有向骨骼肌細(xì)胞分化發(fā)育的能力。眾多動(dòng)物試驗(yàn)及臨床個(gè)案的成功為異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-HSCT)治療DMD提供了有力的證據(jù)，為DMD治療帶來(lái)了新的希望。HLA單倍體相合造血干細(xì)胞移植(haploidentical hematopoietic stem celltransplantation，haplo-HSCT)解決了異基因供者來(lái)源問(wèn)題。但與HLA全相合相比， HLA單倍體相合造

7、血干細(xì)胞移植存在植入失敗率高、造血重建慢、移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）反應(yīng)重、免疫重建遲、致死性感染發(fā)生率高、移植相關(guān)死亡率高等風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，隨著造血干細(xì)胞移植相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，HLA單倍體相合的造血干細(xì)胞移植發(fā)展迅速，已成功跨越HLA限制，使單倍體相合干細(xì)胞移植成為治療的可選擇方案之一。本課題在倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下，開(kāi)展了HLA單倍體相合造血干細(xì)胞移植治療DMD的臨床初步研究。<

8、br>　　 方法：
　　 1.研究對(duì)象的選擇本課題以基因和蛋白診斷明確的DMD患者為主要研究對(duì)象，選取標(biāo)準(zhǔn)包括:4歲＜年齡＜16歲，肝腎功能正常（排除因DMD引起的肝酶升高及肌酐異常），左室射血分?jǐn)?shù)（Left Ventricular Ejection Fractions，LVEF）值＞40％，患者及其家屬自愿申請(qǐng)參加此臨床研究，了解治療風(fēng)險(xiǎn)，簽署知情同意書(shū)，并且獲得珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DMD患者的健康直系親屬作為供者選擇人

9、群，采用直接核苷酸序列分析(Sequenceing-based typing, SBT)進(jìn)行HLA配型的檢測(cè)，選擇與患者至少5/10相合的親屬作為供者。
　　 2.移植方案
　　 患者移植前進(jìn)行自體造血干細(xì)胞動(dòng)員、分離、凍存?zhèn)溆?，保證患者安全。4例患者均選用清髓性的FBCA預(yù)處理方案:氟達(dá)拉濱Flu30mg/m2/d×5d(-9，-8，-7，-6，-5d);白舒非BU0.8mg/kg/q6h/d×4d(-8，-7，-6，

10、-5d);環(huán)磷酰胺CY60mg/kg/d×2d（-3，-2d）;兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白ATG2.5 mg/kg/d×5d(-5，-4，-3，-2，-1d)。供者經(jīng)G-CSF動(dòng)員后分離采集外周血/骨髓干細(xì)胞，分離結(jié)束30min內(nèi)輸注給患者。應(yīng)用環(huán)孢素A（CsA，3mg/kg/d）+短療程甲氨蝶呤(MTX，+1d15mg/m2，+3、+6、+1id分別10mg/m2)的方案預(yù)防GVHD的發(fā)生。應(yīng)用前列腺素E1、肝素鈉預(yù)防肝靜脈阻塞病的發(fā)生，應(yīng)

11、用美司鈉解救、水化、利尿、堿化等預(yù)防出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)的發(fā)生，患者術(shù)前應(yīng)用更昔洛韋清空病毒及抗感染藥物的預(yù)防性、及時(shí)應(yīng)用預(yù)防重癥感染的發(fā)生。移植+1d起使用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、重組人血小板生成素(TPO)等刺進(jìn)造血功能恢復(fù)，促進(jìn)造血重建。
　　 3.術(shù)后造血及植入情況的監(jiān)測(cè)術(shù)后檢測(cè)血常規(guī)明確患者造血重建情況。供受者性別不同者應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescence in

12、 situ hybridization，F(xiàn)ISH）的方法檢測(cè)X、Y染色體探針信號(hào)明確嵌合比例。供受者性別相同者應(yīng)用定期用短串重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction with short tandem repeat，STR-PCR)技術(shù)檢測(cè)患者外周血的短片段核苷酸重復(fù)序列，明確植入狀態(tài)。
　　 4.術(shù)后原發(fā)病的監(jiān)測(cè)術(shù)后每周檢測(cè)患者血清CK等肌酶的變化，擇期對(duì)患者外周血進(jìn)行DMD相關(guān)基因的檢測(cè)，明確

13、基因糾正情況。隨訪觀察評(píng)估患者肢體運(yùn)動(dòng)功能和檢查肌力、反射的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.4例患者納入本研究4例男性患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，入組本研究。中位年齡9歲（6～16歲），以下稱病例1、病例2、病例3、病例4。4例患者DMD基因檢測(cè)結(jié)果分別為Exon51缺失、c.2804-1G＞T突變、Exon2-44缺失、E6c.436C＞T突變。4例DMD患者與供者HLA配型均為單倍體相合，相合位點(diǎn)依次為5/10（母親）、7/1

14、0（父親）、6/10（母親）、5/10（母親），其中病例3供受者血型不合（供者A型，受者O型）。
　　 2.移植干細(xì)胞數(shù)4例患者接受供者外周血及骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，MNC)的中位細(xì)胞數(shù)為8.19×108/kg。其中病例1輸注2次供者外周血干細(xì)胞、1次骨髓干細(xì)胞，3次共接受MNC為6.68×108/kg。病例2接受外周血及骨髓干細(xì)胞各1次，MNC總數(shù)為10.6×108/kg。病例3和病例4只接受1次外

15、周血干細(xì)胞，MNC分別為9.7×108/kg、5.56×108/kg，病例4接受的CD34+細(xì)胞數(shù)為2.45×106/kg。
　　 3.造血重建及植入情況4例患者移植后造血均成功重建。中性粒細(xì)胞＞0.5×109/L的中位時(shí)間為+11d(+10d～+13d)。脫離輸注，血小板維持在＞20×109/L的中位時(shí)間為+10.5d(+10d～+13d)。血紅蛋白＞90g/L的中位時(shí)間為+12.5d(+12～+28d)。4例患者多次檢測(cè)結(jié)果

16、均顯示完全獨(dú)立植入。病例1移植+14d應(yīng)用STR-PCR檢測(cè)示供者獨(dú)立植入，+83d、+343d、+507d應(yīng)用FISH法檢測(cè)結(jié)果均提示完全嵌合。病例2在+13d STR-PCR檢測(cè)提示供者獨(dú)立植入。病例3在+15d FISH檢測(cè)提示完全嵌合。病例4移植+15d、+87d FISH檢測(cè)均提示完全嵌合。病例3供受者血型不合（患者為A型，供者為O型），在移植后+90天左右，患者血型轉(zhuǎn)變?yōu)镺型。病例1術(shù)前合并G6PD酶缺乏癥，術(shù)后經(jīng)檢測(cè)G6P

17、D酶缺乏已被糾正。
　　 4.移植相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生情況4例患者造血重建后均出現(xiàn)了I度aGVHD，發(fā)生aGVHD的中位時(shí)間為+23d(+15d～+33d)。2例患者出現(xiàn)了Ⅰ度cGVHD，發(fā)生的中位時(shí)間為10.5d(+108～+113d)。給與糖皮質(zhì)激素、CD25單抗、間充質(zhì)干細(xì)胞輸注等處理后得到有效控制。目前4例患者分別隨訪至+654d、+338d、+325d、+275d，均無(wú)GVHD癥狀。4例患者中病例1和病例4分別于+30d、

18、+27d出現(xiàn)了出血性膀胱炎，4例患者中有3例患者發(fā)生口腔黏膜炎(oral mucositis，OM)，出現(xiàn)OM的中位時(shí)間為+4d(-11～+17d)。只有病例4，于+194d出現(xiàn)并發(fā)帶狀皰疹。4例患者均出現(xiàn)不同程度的感染，其中3例為肺部感染，1例表現(xiàn)為腸道感染，只有1例患者在+5d時(shí)出現(xiàn)CMV感染。經(jīng)對(duì)癥抗感染治療后，感染均得到有效控制，未出現(xiàn)重癥感染相關(guān)并發(fā)癥。
　　 5.術(shù)后原發(fā)病變化情況本研究中4例患者移植后外周血血清肌酶

19、較移植前有所下降，外周血檢測(cè)基因缺陷被糾正。4例患者在移植后+50d內(nèi)肌力較移植前稍有下降，+150d左右開(kāi)始患者運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度改善，雙側(cè)腓腸肌較前變軟，并隨著時(shí)間增加，肌力漸恢復(fù)至移植前水平。病例1隨訪至術(shù)后21月，患者肌力較前改善，表現(xiàn)為上肢持物力量的增加及行走時(shí)間的延長(zhǎng)。其他3例患者術(shù)后隨訪至+338d、+325d、+236d，患者肌力穩(wěn)定至術(shù)前水平，沒(méi)有像其自然病程一樣進(jìn)行性惡化。
　　 結(jié)論：
　　 1.

20、HLA單倍體相合的造血干細(xì)胞移植雖然存在高風(fēng)險(xiǎn)，但仍可用于治療Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。
　　 2.應(yīng)用FBCA的預(yù)處理方案可保證DMD患者異基因造血干細(xì)胞成功植入，環(huán)孢素A+甲氨蝶呤的方案可有效預(yù)防DMD患者在HLA單倍體相合造血干細(xì)胞移植術(shù)后嚴(yán)重GVHD的發(fā)生。
　　 3.DMD患者在HLA單倍體相合造血干細(xì)胞移植術(shù)后，外周血血清肌酶下降，缺陷基因被糾正，近期隨訪觀察到患者運(yùn)動(dòng)功能不同程度改善。但其遠(yuǎn)期療效仍需