白藜蘆醇對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MCP-1、VCAM-1表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM)大血管并發(fā)癥包括高血壓、冠心病、腦血管疾病及周圍血管疾病，是糖尿病患者死亡的首要原因。大血管病變的主要病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，炎癥及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種自然界中少量存在的

2、非黃酮多酚類化合物，富含于葡萄、虎杖、松樹等多種植物中，是植物在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種強(qiáng)抗氧化劑，具有抗氧化與抗自由基、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、心血管保護(hù)作用、調(diào)脂、降低血糖、改善胰島素抵抗、抗腫瘤及雌激素樣活性等廣泛的生物學(xué)和藥理學(xué)作用。白藜蘆醇可以通過抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抑制VSMCs增殖等作用，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　 核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于單核細(xì)胞、血管平

3、滑肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)，血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)，均是NF-κB通路上的下游因子。NF-κB的激活及各種損傷性刺激可以通過NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)MCP-1與VCAM-1的表達(dá)，促進(jìn)外周血白細(xì)胞-單核細(xì)

4、胞黏附、趨化并遷移至內(nèi)皮下，吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，促進(jìn)VSMCs增殖，參與AS的發(fā)生和發(fā)展。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過不同葡萄糖濃度培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，觀察VSMCs增殖以及NF-κB、MCP-1、VCAM-1的水平變化，同時(shí)應(yīng)用白藜蘆醇和PI3K特異性抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)，觀察白藜蘆醇對(duì)VSMCs增殖的影響，探討白藜蘆醇的抗AS作用的可能機(jī)制，為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　

5、　 1、細(xì)胞培養(yǎng):以大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株A7r5（細(xì)胞株購自中國(guó)培養(yǎng)物典藏中心）為研究對(duì)象。將血管平滑肌細(xì)胞株接種于培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5％CO2孵箱中孵育，待細(xì)胞鋪滿瓶底的90％后進(jìn)行傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別接種于50ml培養(yǎng)瓶和96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48小時(shí)，后更換于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，然后分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):
　　 ①正常對(duì)照組(NG組，含5.5mmol/L葡萄糖)
　　 ②高糖

6、培養(yǎng)組(HG組，含25mmol/L葡萄糖)
　　 ③NG+抑制劑LY294002組（10、20、30μmol/L）
　　 ④HG+抑制劑LY294002組（10、20、30μmol/L）
　　 ⑤NG+白藜蘆醇Res組（25、50、100μmol/L）
　　 ⑥HG+白藜蘆醇Res組（25、50、100μmol/L）
　　 2、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)各組VSMCs的增殖活力。

7、>　　 3、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞上清液中MCP-1、VCAM-1的水平。
　　 4、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)各組VSMCs的NF-κB、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、在高糖誘導(dǎo)下，VSMCs增殖活力顯著增加，明顯高于正常葡萄糖組(P＜0.05);Res（25、50、100μmol/L）以及抑制劑LY294002(10、20、

8、30μmol/L)可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的VSMCs增殖(P＜0.05);
　　 2、高糖孵育組MCP-1和VCAM-1的表達(dá)水平明顯高于正常葡萄糖組(P＜0.05);Res(25、50、100μmol/L)以及抑制劑LY294002(10、20、30μmol/L)可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的MCP-1和VCAM-1的表達(dá)(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;
　　 3、Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:
　　 (1)高

9、糖能使磷酸化的Akt蛋白表達(dá)及NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加，高于正常葡萄糖組(P＜0.05)，但高糖組總的Akt與正常葡萄糖組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　 (2)用不同濃度的LY294002處理高糖孵育的VSMCs后，Akt的磷酸化受到抑制，p-Akt蛋白表達(dá)減少(P＜0.05);用不同濃度的Res(25、50、100μmol/L）處理高糖孵育的VSMCs，也可顯著降低p-Akt蛋白的表達(dá)，且呈濃度依賴性(P＜0.0

10、5);
　　 (3)用不同濃度LY294002處理VSMCs后，總的Akt蛋白水平無明顯升高，與正常對(duì)照組比較，無顯著差異(P＞0.05)，用不同濃度Res處理高糖孵育的VSMCs，能顯著降低總的Akt的蛋白水平，但無劑量依賴性;
　　 (4)用不同濃度的LY294002處理高糖孵育的VSMCs，可見NF-κB的高表達(dá)受到抑制(P＜0.05)，且抑制作用具有劑量依賴性;不同濃度的Res(25、50、100μmol/L)處

11、理高糖孵育的VSMCs，同樣可以抑制NF-κB的表達(dá)，NF-κB水平明顯低于高糖組(P＜0.05)，而且具有劑量依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖可以增加VSMCs的增殖活力;
　　 2、高糖誘導(dǎo)VSMCs的增殖與激活PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞NF-κB和MCP-1、VCAM-1表達(dá)有關(guān);
　　 3、白藜蘆醇可以抑制VSMCs的增殖。白藜蘆醇通過抑制高糖誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路